不明原因復發性流產女性FMR1基因CGG重復序列多態性研究

曹琴英，彭園園，穆衛紅，孫東蘭，張靜

(石家莊市第四醫院產前診斷中心，石家莊 050000)

臨床上自然流產的發生率為15%～25%，其中≥2次流產的患者約占生育期婦女的5%，而≥3次者約占1%。復發性流產(Recurrent spontaneous abortion，RSA)有多種原因，主要包括遺傳因素、解剖因素、內分泌因素、感染因素、免疫功能異常、血栓前狀態、孕婦的全身性疾病及環境因素等[1]。然而，50%的RSA患者病因不明。其中，遺傳因素被認為是主要的潛在原因[2]。

脆性X智力障礙l號基因(Fragile X Mental Retardation 1，FMR1)，又稱家族性智力低下基因，位于染色體Xq27.3。FMR1基因5’端非編碼區CGG三核苷酸串聯重復序列具有高度多態性。根據美國醫學遺傳學學院(ACMG)的脆性X檢測標準和指南[3]，5～44個CGG重復為正常，45～54個CGG重復為中間型，55～200個CGG重復為前突變，大于200個CGG重復為全突變。全突變的臨床表型即為脆性X綜合征，在臨床上有典型的遺傳性智力低下或自閉癥等表現。

近年來，多項研究顯示，CGG重復序列多態性可能在女性不明原因RSA中發揮重要作用。目前，我國尚缺乏大樣本育齡女性FMR1基因多態性的數據，探討RSA患者FMR1基因CGG重復序列數是否高于普通人群的研究更少。本研究旨在對不明原因RSA女性FMR1基因CGG重復序列多態性的分布特點進行分析，以期為自然流產的病因學研究提供參考。

資料和方法

一、研究對象

研究人群為2018年1月1日至2019年12月31日從石家莊市第四醫院復發性流產門診招募的不明原因RSA患者。RSA定義為3次或3次以上在妊娠28周之前的胎兒丟失。但大多數專家認為，連續發生2次流產即應重視并予評估，因其再次出現流產的風險與3次者相近[1]。

納入標準：漢族；年齡<40歲，以最大限度減少因卵巢老化導致的流產患者；連續≥2次孕20周以內的妊娠丟失，且臨床及實驗室檢查未檢出明確原因。排除標準：感染引起的流產史、當前處于妊娠期或產褥期、血栓性疾病、深靜脈血栓形成或肺部病史、子宮或輸卵管解剖異常、宮頸機能不全、骨盆手術史(不包括剖宮產)、酗酒/藥物濫用、癌癥史、染色體異常核型以及輔助生殖技術助孕者。

以同期于石家莊第四醫院婦科門診就診的年齡匹配(±2歲)的無流產史婦女為對照組。

本研究經石家莊市第四醫院倫理評審委員會批準。所有研究對象均自愿進行該項檢查，并簽署知情同意書。

二、研究方法

1.樣品采集與DNA提取：抽取研究對象外周靜脈血2 ml，EDTA抗凝。使用QIAamp全血DNA提取試劑盒(Qiagen，德國)提取DNA，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。NanoDrop 1000(Nanodrop，美國)測定DNA濃度。

2.FMR1基因CGG重復數檢測：采用FMR1基因CGG重復數檢測試劑盒(熒光PCR-毛細管電泳法，北京閱微基因技術)檢測FMRl基因的CGG重復次數。按試劑盒的說明操作，主要步驟如下：(1)建立PCR擴增體系：15 μl全長擴增體系，包括擴增緩沖液11.5 μl、全長擴增引物0.6 μl、酶混合液0.3 μl、無核酸酶純水1.6 μl，充分混勻后加入待檢測1 μl DNA樣本；15 μl重復擴增體系，包括擴增緩沖液11.5 μl、重復擴增引物0.6 μl、酶混合液0.3 μl、無核酸酶純水1.6 μl，充分混勻后加入待檢測1 μl DNA樣本。(2)PCR反應條件：兩種PCR擴增體系的反應條件相同，均為95℃ 5 min，97℃ 35 s、65℃ 35 s(在此步驟中，每1個循環減1℃)、68℃ 4 min共10個循環；然后接97℃ 35 s、62℃ 35 s、68℃ 4 min(在此步驟中，每1個循環增加20 s)，共20個循環；68℃ 10 min后，連接15℃完成擴增反應。(3)毛細管電泳：HiDi Formanmide(ABI，美國)8.7 μl、QD1200(ABI，美國)0.3 μl、PCR產物1 μl配制電泳檢測樣品，使用POP7膠(ABI，美國)在Applied Biosystems 3500xl DNA測序儀(ABI，美國)上進行毛細管電泳檢測。選擇“Fragment”電泳方法，具體操作按使用說明書。

3.結果分析：檢測數據使用GeneMapper分析軟件(ABI，美國)進行數據分析。具體操作步驟參考GeneMapper分析軟件用戶使用手冊。采用目前國內外普遍采用的分類：(1)正常重復范圍(n=5～44)；(2)中間型(n=45～54)；(3)前突變(n=55～200)；(4)全突變(n>200)。

三、統計學方法

采用SPSS 24.0統計學軟件進行統計分析。在同一個體中FMRl的兩個等位基因(CGG)重復次數相對少者定義為allele-1，相對多者定義為allele-2，取allele-2的重復數進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；比較兩個隊列之間的顯著性水平，采用Fisher精確檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、患者一般情況

研究組共納入不明原因RSA患者340例，平均年齡(32.5±3.2)歲，平均流產次數(2.51±0.53)次。其中，流產2、3、4、5次的患者分別有206例(60.60%)、100例(29.40%)、30例(8.82%)和4例(1.18%)。對照組340例，平均年齡(32.3±3.3)歲。兩組病例年齡比較無顯著性差異(P>0.05)。

二、兩組CGG重復序列數比較

研究組CGG重復序列數范圍為15～70次，平均(29.29±5.31)次。共30種不同的CGG重復數，頻率最大的重復次數為29次(41.5%)，其次為30次(38.8%)、36次(8.2%)。

對照組CGG重復序列數范圍為17～48次，平均(28.88±5.97)次。共29種不同的CGG重復數，頻率最大的重復次數為29次(43.2%)，其次為30次(42.6%)、31次(2.9%)。

兩組間CGG重復序列數比較無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組FMRl基因CGG重復序列分布比較[n(%)]

三、兩組CGG重復序列分型比較

兩組均無全突變型攜帶者。研究組FMRl基因中間型患者8例(2.35%)，對照組FMRl基因中間型1例1/340(0.29%)，組間比較有顯著差異(P<0.05)；研究組FMRl基因前突變患者2例(0.59%)，對照組無FMRl基因前突變攜帶者，組間比較無顯著性差異(P>0.05)；研究組中CGG重復≥35次的正常等位基因患者35例(10.29%)，對照組12例(3.53%)，組間比較有顯著差異(P<0.05)(表2)。

表2 研究組與對照組CGG重復序列數比較[n(%)]

討 論

文獻報道，FMR1基因前突變與卵巢早衰顯著相關，前突變攜帶者卵巢早衰(POF)發病率高達13%，自然絕經時間較早，與卵巢儲備功能相關的指標如血清抗苗勒管激素(AMH)、基礎FSH水平等出現異常[4-5]。而且有學者指出，卵巢儲備功能減退相關的卵母細胞特異性基因與RSA相關，并提出在不明原因的RSA患者中進行上述相關基因的檢測[6]。因此，我們推測FMR1基因在RSA中亦發揮作用。

最近，國內外數篇文獻報道了FMR1基因CGG重復序列多態性與反復流產之間的關系。希臘一項前瞻性病例對照研究，對49名≤40歲的不明原因RSA女性及49例年齡匹配的正常女性進行檢測發現，CGG重復次數存在顯著差異(P=0.027)，流產患者前突變攜帶風險顯著高于正常對照組(OR=4.267)[7]。印度Dean等[8]研究顯示，與對照組相比，RSA組中間型等位基因攜帶者頻率更高(5/100 vs.2/100)；此外，RSA組CGG重復數≥35個的正常等位基因的比例更高(24/200 vs.8/200)，單純CGG重復序列(無AGG嵌入)的比例顯著增加(15/200 vs.3/200，P=0.006)。這種單純CGG重復序列數在下一代中易發生增加，可能具有導致反復流產的致病性后果。國內陳蔚琳等[9]進行的全國多中心橫斷面研究顯示，反復生育失敗婦女的FMRl基因前突變攜帶者發生風險較高，為1/369。針對中國北方育齡期婦女的研究顯示，具有自然流產史或因胚胎發育遲緩而人工流產史女性的前突變攜帶率為1/320，高于無流產史女性的1/756[10]。馮旺琴等[11]研究發現，早期自然流產患者FMRl基因中間型攜帶率與對照組無顯著差異(1/222 vs.1/247)，但前突變攜帶率顯著高于對照組(1/400 vs.1/740，P<0.05)。但本研究發現，不明原因RSA患者FMR1基因的中間型和正常范圍內的高CGG重復序列數攜帶比例均顯著高于對照組，而前突變攜帶率并未顯著增加，這與國內馮旺琴等[11]研究結果不同，但與Dean等[8]的研究結果相似。分析可能的原因：一方面可能是本研究的樣本量太小，導致了數據偏倚；此外，受試者的遺傳背景可能存在一定的地區差異；再者，受試者納入/排除標準有所差異。本研究的入組標準更為嚴格，且最大年齡較馮旺琴等[11]研究更小，以最大限度減少因卵巢老化導致的流產患者；而且流產孕周截止時間為孕20周以內，而馮旺琴等[11]研究的受試者均為孕早期(孕5～12周)RSA患者。上述差異可能導致了兩項研究結果的不一致。對于我國不明原因RSA患者的FMR1基因CGG重復序列分型特點，尤其與不明原因RSA的相關性還有待更多更大樣本量的、設計更嚴謹的研究予以闡明。

回顧文獻，FMR1中間型等位基因與生育力降低、月經不規則、更年期提前、原發性卵巢功能不全(POI)、非整倍體發生率更高以及流產相關[8]。在POI和卵巢儲備功能降低患者中，較大的正常等位基因重復頻率增加[12]。Kline等[13]的研究顯示，與對照組相比，FMR1基因CGG重復序列數增多在三體性自然流產的婦女中所占比例更高。Kline等[13]曾推測流產的增加可能與卵巢卵母細胞池的減少有關，FMRl基因的前突變攜帶者，卵巢儲備功能下降，二者之間可能存在某種關聯[14-16]。中間型和較大的正常型FMR1等位基因很可能導致卵巢儲備減少，在這種情況下，受損的卵母細胞質量最終可能導致致命的遺傳缺陷，如非整倍體，從而導致流產。這一假設得到了如下研究結果的支持：CGG重復次數大于30次的女性卵巢儲備減少，AMH和FSH水平等卵巢功能參數異常[17-18]。研究證實，血清AMH水平的降低和血清FSH水平的升高與流產相關，從而提供了中間型和較大的正常型FMR1等位基因與RSA相關的證據[8]。

2013年Banerjee等[19]觀察到，在不明原因RSA患者中，PGE2的表達顯著增加。脆性X智力障礙相關蛋白1(FXR1)是脆性X智力低下綜合征蛋白(FMRP)的同源物，與FXR2結合形成RNA結合蛋白的FXR家族[20]。FXR蛋白靶向RNA結合域[21]具有與轉錄后調控作用(可能包括mRNA核質穿梭以及翻譯)相一致的特征[22]。2019年最新研究發現，FXR1敲除可促進原代細胞滋養層中PGE2的產生。這些結果提示FXR1參與RSA的發病機制。FXR1可能是一種新的COX-2調節因子。與健康對照組相比，RSA患者的滋養層FXR1 mRNA表達水平顯著降低，COX-2 mRNA表達水平升高。因此，FXR1在早孕中起著關鍵作用，可能是RSA的潛在治療靶點[23]。

本研究的主要局限性在于我們沒有分析病例組和對照組的AMH和FSH水平。因此，需要進一步的前瞻性研究來證實FMR1基因CGG重復序列與反復妊娠丟失之間的可能聯系，并揭示相關的分子機制。

綜上，我們檢測了不明原因RSA女性中FMR1基因CGG重復序列數的分布情況。結果表明，較大的正常型以及中間型FMR1等位基因可能在不明原因的RSA中發揮作用。未來還需要對此進行更多的研究，以揭示其分子機制。