改進傳代誘導法高效誘導人胚胎干細胞定向分化為內胚層細胞

崔羅方，王亞娜，宋曉聰，閆萌萌，馬文華，許曉琳，尤雪劍，劉麗，張艷，安思琪

(滄州醫學高等專科學校，滄州 061000)

胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESCs)是一種發生在胚胎早期的全能性干細胞。這類干細胞通常被認為具有極其強大的組織分化能力和無限的增殖能力，研究者們發現ESCs具有分化為全身不同的細胞類型及廣泛存在于機體的各種組織、器官的潛能[1]。

現在，ESCs已經廣泛地應用于臨床細胞治療、基因修復、發育學的基礎研究及癌癥治療等多個領域[2]。ESCs具有誘導分化成為外胚層、中胚層、內胚層多種組織和細胞的能力[3-4]，其中內胚層能夠誘導分化形成消化和呼吸系統等重要器官如肝臟、胰腺、胃腸道、呼吸道和肺臟。對于內胚層組織來源的臨床疾病如糖尿病、急慢性肝臟疾病、胃腸道疾病及呼吸道疾病等，細胞移植是有效的治療技術手段，但是有限的內胚層細胞來源卻嚴重地制約著細胞移植治療技術的更廣泛開展和應用。利用人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)誘導分化為人類內胚層組織細胞，有望為臨床細胞移植治療內胚層組織來源的疾病提供極為豐富的組織細胞來源。但人類內胚層細胞誘導難度大，效率低下，如何高效地誘導hESCs分化為人類內胚層細胞仍是目前研究的熱點。在以往的研究中，許多學者發現activin A可成功地促進胚胎干細胞向內胚層分化發育。但傳統的實驗方法直接在hESCs中加入activin A，內胚層分化的效率不高。本研究采用最新改進的體外傳代誘導法，使用activin A誘導hESCs分化，比較內胚層標志物(SRY-related HMG-box gene 17，SOX17)和叉頭框A2(Forkhead box transcription factor A2，FOXA2)表達水平，尋求建立一個更加穩定高效的hESCs向內胚層誘導分化的體系。

材料與方法

一、材料

1.細胞株：人類胚胎干細胞(hESCs)H9細胞株，購自ATCC細胞庫；小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)由孕12.5 d的昆明小鼠的胚胎制作，作為hESCs的滋養層細胞。

2.主要試劑：高糖Knockout DMEM、DMEM/F12、Knockout SR、β-巰基乙醇、IV膠原酶(GIBCO，美國)；胰蛋白酶(Sigma，美國)；基底膜提取物(BME)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、activin A、FOXA2山羊抗人單克隆抗體、SOX17山羊抗人單克隆抗體(R&D systems，美國)；驢抗山羊IgG、DAPI(Invitrogen，美國)。

3.儀器設備：倒置相差顯微鏡(DMIL-PH1，徠卡，德國)；超凈工作臺(山東博科生物)；熒光顯微鏡(Eclipse 80i型，Nikon公司，日本)。

二、研究方法

1.滋養層細胞MEF的制作與培養：酒精消毒處死后的12.5 d昆明孕鼠，移入超凈工作臺內，取出孕鼠子宮內的胎鼠，將胎鼠的內臟、肢體、頭尾等組織丟棄，僅保留胎鼠的軀干部分，用眼科剪將胎鼠軀干剪成糊狀組織小塊，放入離心管中，加入與胎鼠組織樣品等體積的胰蛋白酶消化液消化，為了增加消化效果，將離心管移至37℃、CO2培養箱消化10 min后取出，裝有小鼠胚胎的離心管在室溫內自然沉淀，用無菌吸管吸出管中含有小鼠胚胎細胞的上清液備用，剩余的胚胎組織再次加入胰蛋白酶進行消化，重復上述消化步驟，直至小鼠胚胎組織完全溶解。將幾次消化后收集的含有小鼠胚胎細胞的上清液再加入含血清的培養基終止消化，靜置沉淀后保留離心管底部的小鼠胚胎細胞，棄去上層液體，加入新的MEF培養基中止細胞的消化并用無菌吸管輕輕吹打使小鼠胚胎細胞充分混勻，將混勻后的小鼠胚胎細胞懸液均勻地接種于六孔培養板上，移入37℃、CO2培養箱培養，每日或隔日更換一次MEF細胞培養基。待MEF生長至即將鋪滿培養板時，液氮凍存MEF備用。

2.hESCs 體外培養：將已從液氮中取出的hESCs 凍存管在水浴箱內進行細胞復蘇，復蘇前應首先確保MEF已經在六孔培養板上準備好且細胞生長狀態良好，復蘇后將準備好的hESCs凍存液接種于60鈷γ射線處理過的滋養層細胞MEF上，加入hESCs培養基培養，培養基主要成分為：含20% knockout SR的F12培養基，添加0.1 mM β-巰基乙醇、1 mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L非必需氨基酸、4 ng/ml bFGF，hESCs培養于37℃、CO2培養箱內，細胞每天換液一次并在倒置相差顯微鏡下觀察hESCs的生長狀態并判斷hESCs是否分化。

3.制作基底膜提取物包被的六孔板：六孔板每孔加入1 ml基底膜提取物，放入37℃、CO2溫箱孵育。1 h后取出六孔板，吸走基底膜提取物，將六孔板在超凈臺內晾干，備用。

4.誘導hESCs向內胚層分化：改良傳代誘導組(改良組)：取出一只生長在MEF上的hESCs六孔培養板，用無菌槍頭吸出板內的培養基，用無菌PBS洗滌兩遍后棄去PBS，每個培養孔加入少量1 mg/ml IV型膠原酶，移入37℃培養箱進行消化，數分鐘后在倒置顯微鏡下觀察，當多數的hESCs細胞克隆由于IV型膠原酶的消化作用即將離開培養板底部時，用無菌槍頭吸出板內的膠原酶，無菌PBS輕柔洗滌兩遍培養板，制備含100 ng/ml activin A的hESCs誘導液，用無菌槍頭直接吸取誘導液，輕輕地吹打培養板上的hESCs，顯微鏡下仔細觀察hESCs克隆被吹打為單個細胞后可暫時停止培養板的吹打。將培養板內含有吹散的hESCs的誘導液接種到預先準備好的鋪有基底膜提取物的六孔培養板上，誘導3天，使hESCs直接向人內胚層方向分化。

傳統誘導組(傳統組)：取出一只生長在MEF上的hESCs六孔培養板，用無菌槍頭吸出板內的培養基，用無菌的PBS洗滌兩遍后棄去PBS。制備含100 ng/ml activin A的hESCs誘導液，用無菌吸管將hESCs誘導液吸入培養板內誘導3 d。

兩組細胞放置于37℃、CO2溫箱孵育，隔天換液一次。每日在倒置相差顯微鏡下觀察誘導細胞的形態及生長狀態。

5.細胞免疫熒光化學：將六孔培養板上用activin A誘導3 d的兩組細胞從CO2培養箱中取出，吸出孔內的誘導液，用無菌PBS洗滌3遍；然后將每孔的細胞放入含有4%多聚甲醛的PBS固定20 min，再次用PBS洗滌3遍；每孔加入0.2% Triton X-100在室溫下破膜30 min，破膜后再用PBS洗滌3遍，清洗干凈后用吸水紙吸干孔內殘留的PBS。在六孔培養板內加入與二抗相同來源的血清室溫下封閉30～60 min，封閉后用PBS洗滌3遍；吸水紙吸干PBS后每個培養孔內加入稀釋后的一抗(1∶200稀釋)并放入濕盒內，在4℃下放置過夜，PBS洗滌3次，吸水紙再次吸干孔內殘留的PBS。在避光的環境下加入二抗(1∶200稀釋)在室溫下連續作用1 h，PBS清洗3次；再避光加入DAPI染核30 min，之后用PBS洗滌干凈DAPI。熒光顯微鏡下觀察兩組內胚層特異性標志物SOX17和FOXA2的表達水平。

三、統計學分析

結 果

一、hESCs及分化的細胞形態學觀察

倒置相差顯微鏡下觀察MEF、hESCs及誘導細胞的形態。MEF生長在六孔培養板的底部，為中間略寬、兩端尖銳的紡錘形的細胞，胞體較大，細胞輪廓清晰，有些可有細胞突起，形態彎曲，呈螺旋狀有序地排列，細胞核呈現規則的卵圓形，核仁大而明顯，可有多個核仁。hESCs呈克隆狀有序地增殖，細胞克隆集落呈現類圓形，邊緣清晰、光滑，集落邊緣為MEF，隨hESCs克隆逐漸生長體積增大，克隆邊緣的MEF被推擠至hESCs克隆的外緣，hESCs細胞之間排列致密，細胞間界限不明顯(圖1C)。activin A誘導hESCs 3 d后，相當數量的hESCs死亡，漂浮于六孔培養基中，存活的細胞則貼著培養板底部生長。改進組誘導3 d的細胞體積變大，呈現多角形或者不規則形態，凸起較多，細胞之間界限清楚，多數成群聚集生長，遺留片狀空白無細胞區域，細胞核呈現卵圓形，體積大，核仁明顯(圖1A)。傳統組誘導3 d的細胞多數聚集呈集落樣生長，位于集落中間的細胞仍保留著未分化的hESCs形態，細胞體積變化不大，形態變化也不明顯，細胞與細胞之間界限不清(圖1B)。

A：改良組activin A 誘導3 d的細胞；B：傳統組activin A誘導3 d的細胞；C：生長在 MEF上的未分化的hESCs

二、內胚層標記物FOXA2檢測

改良組細胞使用新改進的傳代誘導法，用activin A誘導hESCs 3 d后，細胞免疫熒光顯示多數細胞表達內胚層蛋白FOXA2(圖2A)，相較于傳統的直接在未消化的hESCs加入activin A誘導的傳統組細胞(圖2B)，FOXA2的表達率[(92.5±4.3)% vs.(56.9±7.3)%]顯著升高(P<0.05)。

A：改進組；B：傳統組

三、內胚層標記物SOX17檢測

改進組細胞使用新改進的傳代誘導法，用activin A誘導hESCs 3 d后，細胞免疫熒光顯示多數細胞表達內胚層蛋白SOX17(圖3A)，相較于傳統的直接在未消化的hESCs加入activin A誘導的傳統組細胞(圖3B)，SOX17的表達率[(85.5±6.5)% vs.(36.8±5.8)%]顯著升高(P<0.05)。

A：改良組；B：傳統組

討 論

ESCs具有自我分化為外胚層、中胚層和內胚層多種組織細胞的潛能。因此，它在早期胚胎發育、疾病、表觀遺傳學和人體病理生理學、藥物的篩選等研究領域被廣泛應用[5-7]，并為再生醫學的細胞替代治療提供無限的多種組織細胞來源，具有極其重要的臨床意義[8-10]。ESCs的臨床治療和生物學研究被廣泛應用的一個重要步驟是將ESCs分化為特定的組織和細胞類型。這些組織器官最初的形成與胚胎三個胚層的發育相對應。例如神經、上皮組織及相關結構由外胚層分化形成；骨骼、肌肉、脂肪、腎臟以及循環系統則由中胚層分化形成；消化和呼吸系統的器官如肝、胰腺、腸和肺是由內胚層分化形成[11]。迄今為止，ESCs向內胚層分化研究已經取得了一些成果，研究者們已經能夠成功將ESCs誘導為肝臟和膽管細胞、胰島細胞、小腸上皮細胞、膀胱細胞和肺泡細胞等多種內胚層來源的細胞[12-13]。內胚層細胞由于其器官的復雜性而難以進行誘導分化，但獲得人類內胚層細胞對于細胞移植治療糖尿病、急慢性肝臟疾病、胃腸道疾病及肺臟疾病等具有極為重要的臨床意義[14]，所以hESCs向人類內胚層細胞進行誘導分化仍然是目前hESCs分化方向的研究熱點。如果能夠獲得高純度的hESCs來源的人類內胚層細胞，對更好地治療內胚層相關組織的疾病具有極大的推動和促進作用。因此，選擇合適的誘導因子和誘導方式有助于更加有效地誘導hESCs分化為高純度的內胚層細胞，并進一步誘導分化為相應的內胚層組織和器官。

SOX17屬于SOX家族的成員，在內胚層的發育過程中起著必不可少的作用。Schroeder等[15]發現SOX17在嚙齒類動物內胚層發育過程中表達。FOXA2是FOX-box基因家族的一員，它貫穿于內胚層細胞的整個發育過程。定型內胚層最終發育為原始消化道，FOXA1與FOXA2在原始消化道都有表達，FOX家族對起源于原始消化器官的發育起著重要的作用。研究結果表明，SOX17和FOXA2在內胚層的形成和發育的過程中不可或缺，它們可以作為鑒別內胚層是否形成的重要標志物，并可評估內胚層細胞的分化效率[16]。

將hESCs分化為各種譜系細胞需要多種特定信號途徑來精細調節。hESCs向內胚層分化的過程涉及到許多重要的信號通路，Nodal、BMP、Wnt、FGF等信號通路均參與hESCs向內胚層分化的過程[17-18]。研究表明，activin A、BMP4、FGF2、Wnt-3a等細胞因子均能誘導hESCs向內胚層方向分化，但分化效率不理想；此外，研究人員發現，維甲酸、二甲基亞砜、地塞米松等化學誘導劑也能起到類似的作用[19]。化學誘導劑雖然具有簡單、價格低廉等優點，但其主要缺點就是它的分化效率與細胞因子相比更為低下。Activin A為較常用的一種誘導hESCs分化為人類內胚層細胞的誘導因子。Hinton等[20]將胚胎干細胞用濃度為100 ng/ml的activinA處理4 d，再用25 ng/ml Wnt3a處理1 d，使其成功分化為定型內胚層細胞。Teo等[21]使用activin A與BMP4聯合誘導hESCs，發現與單獨使用activin A誘導hESCs相比，定型內胚層的分化效率提高了15%～20%，內胚層細胞基因CXCR4、SOX17和FOXA2的表達率也顯著增加。

研究發現，雖然誘導因子activin A能夠成功的促使ESCs向內胚層方向分化，但是加入誘導因子的方式不同可顯著影響內胚層細胞的分化效率。以往傳統的誘導方式基本是在未消化的hESCs中直接加入誘導因子，但是此種傳統誘導方式的缺點也不容忽視：由于hESCs聚集生長呈團狀，互相之間排列十分緊密，導致單個hESC不能充分接觸誘導因子，且緊密相連的hESCs之間可能存在著相互作用，影響它們向內胚層細胞進行分化。本研究中，我們對于誘導方式采取創新的方式，先將生長狀態良好的hESCs用膠原酶消化為單個細胞，然后加入含有activin A的誘導液，使hESCs充分接觸誘導液，而且單個hESCs不會與相鄰細胞產生相互作用，影響分化效率。另外，改進傳代方法相較于傳統誘導方法，內胚層標志物SOX17和FOXA2的表達率均有了顯著的提高。

以往的實驗研究經常集中于ESCs向內胚層發育過程中的信號通路，研究內胚層發育過程中不同誘導因子對ESCs的影響，從而選擇不同的誘導因子來提高ESCs向內胚層分化的分化效率。但本研究發現，通過改進實驗方法，activin A本身就可高效誘導ESCs向內胚層分化。此方法經濟簡潔，并可有效提高內胚層細胞的分化效率，對進一步誘導ESCs分化為內胚層組織和器官具有重要意義，可為臨床移植治療糖尿病、肝臟疾病、腸道疾病及肺臟疾病等提供無限的組織細胞來源。