2020年寧波市主養海水魚流行病學調查與藥敏試驗

徐勝威, 葛明峰, 許昊川, 王雯瓊, 沈偉良

2020年寧波市主養海水魚流行病學調查與藥敏試驗

徐勝威, 葛明峰*, 許昊川, 王雯瓊, 沈偉良

（寧波市海洋與漁業研究院, 浙江 寧波 315042）

為了解寧波地區水產養殖品種病害發生情況, 本研究于2020年通過定期抽檢與應急檢測相結合方式, 開展了地區性的主要海水魚流行病學調查工作. 從大黃魚、小黃魚、七星鱸魚、銀鯧等海水魚上共分離到細菌19株, 主要菌株為哈維氏弧菌和美人魚發光桿菌; 檢測出病毒陽性26批次, 主要為傳染性脾腎壞死病毒和真鯛虹彩病毒; 鏡檢觀察到寄生蟲2例, 分別為東方魚虱和梅氏新本尼登蟲. 藥敏試驗結果顯示: 從魚體分離得到的致病菌對鹽酸多西環素、氟甲喹敏感2種藥物的最小抑菌濃度(MIC)普遍＜0.1mg·L-1, 因此其可作為優選藥物進行細菌病的治療. 另外發現在不同時間段, 大黃魚上分離到的同種細菌對藥物的敏感性并不一致. 藥敏試驗結果將有助于養殖戶做到科學、精準用藥, 同時也能為本地水產養殖動物病原菌的耐藥性普查工作提供理論基礎.

海水魚; 病害; 流行病學; 藥敏試驗

每年水生動物病害的頻繁發生, 給寧波市漁業帶來了約占養殖產業7%~8%的重大經濟損失[1], 還帶來了水產品質量安全隱患, 嚴重制約了漁業的快速發展. 近年來, 不少水產領域學者對本地區水生動物主要病害進行了流行病學調查與研究, 以期了解相關病害對魚蝦貝藻等養殖品種的危害程度、流行特點和發病規律, 從而制定防控措施, 保障漁業積極向上發展[2-4].

盡管如此, 但相關研究并不全面, 水生動物病害已成為制約我市水產養殖健康、持續、快速發展的主要原因之一. 鑒于此, 本文開展了2020年寧波市主養海水魚流行病學調查, 以期做好相關病害防治工作, 提高水產養殖效益. 同時, 對分離到的主要致病菌開展藥物敏感性試驗, 為養殖戶病害早期診斷和藥物合理施用提供一定的科學依據, 減少病害帶來的損失. 同時, 藥敏試驗結果也能為本地水產養殖動物病原菌的耐藥性普查工作提供理論基礎.

1 材料和方法

1.1 調查動物與取樣方法

本次調查動物以大黃魚()為主, 同時也涵蓋小黃魚()、七星鱸魚()、銀鯧()、赤點石斑魚()等品種. 調查工作包括定期抽檢與應急檢測. 4~10月每月從象山、奉化、寧海監測點采樣1次. 挑選臨床癥狀明顯的活體或瀕臨死亡的水產養殖動物, 現場進行細菌劃線分離和寄生蟲鏡檢, 同時取疑似病灶組織置于95%乙醇中固定, 送回實驗室進行病毒檢測. 對于突發病害的養殖動物, 按上述步驟進行取樣檢測.

1.2 試劑耗材

DNA的提取采用OMEGA E.Z.N.A.?Tissue DNA Kit, PCR試劑選用康為世紀2×Taq Master Mix(含染料), 相關引物由北京六合華大基金科技股份有限公司合成. 動物用藥敏檢測分析試劑盒、試劑板由南京菲恩醫療科技公司提供.

1.3 檢測方法

1.3.1 細菌分離與鑒定

無菌條件下, 取魚肝、脾、腎、腦等組織劃線接種于腦心浸出液瓊脂(BHI)平板上, 28℃培養24~72h, 挑取單菌落于28℃條件下純化培養. 細菌DNA提取參照OMEGA試劑盒說明, 根據16S rDNA序列合成引物, 建立PCR擴增體系[5]. PCR產物測序交由北京六合華大基金科技股份有限公司完成, 測序結果經Genbank Blast比對進行細菌鑒定. 同時, 挑選純化好的單菌落用于后續的藥敏試驗.

1.3.2 藥敏試驗

參照南京菲恩醫療科技公司的藥敏分析試劑板說明書. 將純化后的單菌落先于生理鹽水中制成0.5麥氏單位濃度的菌懸液, 之后稀釋成5×105cfu?mL-1, 以每孔200μL分別加到8種不同濃度梯度(0.1~200mg?mL-1)藥物內. 接著, 將藥敏分析試劑板置于28℃環境, 培養24~48h后讀取結果.

1.3.3 病毒檢測

魚類傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)檢測分別參照SC/T 7211-2011、GB/T 36191-2018提供的檢測方法進行病毒檢測.

1.3.4 寄生蟲檢測

利用水浸片法鏡檢. 取魚鰓絲、體表附著物或粘液置于載玻片上, 滴加無菌生理鹽水, 用鑷子將組織分散, 蓋上蓋玻片, 稍加壓平, 置于顯微鏡下觀察.

2 結果與分析

2.1 病原檢出統計

2020年4~10月采集的水生動物中共分離到細菌19株. 其中, 大黃魚體內分離出12株細菌, 占總菌株數的63.2%. 銀鯧、鯔魚、小黃魚上各分離出2株, 七星鱸魚分離出1株. 共檢測病毒34批次, 檢出病毒陽性共計26批次, 其中檢出ISKNV 17批次、RSIV 9批次, 同時檢出ISKNV和RSIV 7批次, 這兩類病毒主要感染大黃魚、七星鱸魚、赤點石斑魚和銀鯧. 另外, 從大黃魚和鯔魚體表上分別檢出1例梅氏新本尼登蟲()和1例東方魚虱(,Gussev). 病原具體檢出情況見表1.

表1 水生動物各類病原檢出情況統計

2.2 細菌分離統計

表2 采樣月份和菌株數統計 株

注: “-”為未分離到病菌.

表3 各致病菌對抗菌藥物的敏感性 mg?L-1

2.3 細菌藥敏試驗

對上述分離到的細菌經種屬鑒定后, 進行藥物敏感性試驗, 檢驗原理為微量肉湯稀釋法. 根據南京菲恩醫療科技公司提供的藥敏分析試劑板,得出的MIC值可為后期科學用藥提供有力依據. 藥敏具體結果見表3.

表4 大黃魚不同時間段分離的哈維氏弧菌對藥物的敏感性 mg?L-1

2.4 病毒檢出統計

ISKNV和RSIV是目前已發現存在于大黃魚內, 且攜帶率較高, 對其機體影響較大的2種病毒. 此次在海水魚上共檢出26批次病毒陽性, 其中ISKNV檢出17批次, RSIV檢出9批次(表5). 前者主要感染大黃魚、七星鱸魚、銀鯧、赤點石斑魚等海水魚, 尤以大黃魚和七星鱸魚上檢出批次較多, 分別為6批次和5批次; 后者從大黃魚上檢出批次最多, 同時也可感染赤點石斑魚和銀鯧.

采集的患病魚癥狀為脾腎腫大, 部分魚鰓絲發白, 肝腫大, 發黃甚至發白. 傳染性脾腎壞死病毒和真鯛虹彩病毒雖然本身對海水魚致死性不高, 但會破壞魚體免疫系統, 往往引起魚免疫力下降,從而繼發細菌性疾病. 如8月5日, 象山黃避岙養殖銀鯧發病, 臨床癥狀為魚頭部、鰭條基部出血, 解剖發現其脾腎腫大, 經PCR技術檢測到病魚同時感染ISKNV和RSIV. 同時, 從該魚肝、腎組織中分離出大量的美人魚發光桿菌. 這可能是由于病毒感染導致魚體免疫力下降, 從而作為海水中常見的條件致病菌, 美人魚發光桿菌感染魚體, 從而發生病害.

表5 海水魚病毒檢出統計

本次調查在4~8月都有檢出上述病毒, 應引起養殖戶高度重視. 養殖戶在前期應選擇健康無病毒的魚苗進行放養, 并控制一定的放養密度, 同時定期在飼料中添加多種微生物、抗病毒中草藥和低聚糖等免疫增強劑來提高魚體抗病能力, 防止病害的發生和流行.

2.5 寄生蟲觀測統計

5月11日在寧海大佳何鎮養殖鯔魚中檢出東方魚虱1例. 患病鯔魚鱗片脫落嚴重, 鰭條、鰓絲明顯斷裂, 并伴有體表出血; 在鱗片、鰓蓋邊緣、鰭條等處觀察到大量東方魚虱.隨著蟲體不斷繁殖, 體表創傷愈加嚴重, 水體條件使致病菌亦乘虛侵染魚體, 并局部繁殖引起魚體炎癥反應. 而后, 致病菌隨血液循環感染肝、脾、腎等組織, 最終導致魚體從體表潰爛到全身組織受損. 通過平板劃線分離, 在患病鯔魚組織中分離到2株哈維氏弧菌, 表明魚體因東方魚虱寄生引起的細菌繼發感染.

9月14日于象山石浦網箱養殖大黃魚上觀察到梅氏新本尼登蟲. 患病大黃魚頭部磨損呈蜂窩狀裸露, 眼球突出變白, 似白內障癥狀, 體表分泌大量粘液并伴有炎癥. 本尼登蟲的大量寄生引起魚體瘙癢, 病魚焦躁不安, 不斷狂游與網箱等硬物摩擦致使體表擦傷出血, 引起繼發性感染, 導致體表肌肉潰瘍. 該病的流行主要在秋季, 最適蟲群增長水溫為25~26℃, 而當時采樣環境條件恰是本尼登蟲感染的高發期.

寄生蟲病在不同養殖區域也有病害發生的報道[10-11], 如刺激隱核蟲、微孢子蟲等寄生蟲對大黃魚及其他海水魚的危害愈加嚴重, 會引起魚體繼發細菌感染和缺氧. 但從2020年調查分析可知, 寧波周邊養殖場大黃魚刺激隱核蟲病的防控措施做得較好, 發生病害的范圍也較少.

2.6 其他病害

由于養殖環境日趨復雜化, 許多原因不明的疾病和綜合癥也不斷突顯. 7月21日, 象山一網箱養殖大黃魚發現了白鰓病, 病魚體表完好無損, 未見鱗片脫落或充血潰爛等癥狀, 鰓絲完整, 但失血呈蒼白色, 脾臟大多數充血或腫大變黑, 腸道多數有炎癥. 但白鰓病究竟是病毒引起, 還是粘孢子蟲感染所致, 亦或為細菌性疾病, 有待進一步深入研究[12-13]. 從發病季節來看, 作為大黃魚“三白之一”的白鰓病主要流行于高溫季節, 低溫環境不易爆發, 但不代表不存在該病原, 也不能說明低溫環境不存在傳播的可能性.

3 總結與討論

大黃魚是寧波地區的主要養殖品種, 于20世紀80年代開始養殖[14]. 開展以大黃魚為主的海水魚流行病學調查對探索養殖動物主要病害的流行規律, 提前預警和防控具有重要的意義. 本研究顯示, 哈維氏弧菌是引起海水魚發病的主要致病菌. 其致病途徑一方面是由于魚體感染傳染性脾腎壞死病毒、真鯛虹彩病毒或寄生蟲后, 魚體免疫力降低或體表受創, 導致條件致病菌繼發性感染; 另一方面由于水質環境惡化, 有害細菌繁衍迅速, 加上氣候多變, 使得養殖品種更易感染病菌, 特別是在高溫、臺風、梅雨等惡劣天氣狀況下.

雖然通過藥敏試驗, 可以在細菌性疾病發生時采用對癥藥物進行治療, 但有時也會出現根據藥敏試驗結果服用漁藥效果不好的情況. 究其原因, 一方面, 市面上漁藥魚龍混雜, 很多養殖戶對漁藥缺乏科學的認知和辨別. 一旦購買了假藥、劣藥進行投喂, 不但魚病得不到及時治療, 還會加重魚體代謝負荷, 使病情進一步惡化. 另一方面, 某些養殖戶投藥方法不當, 導致療效不明顯. 對于濃度依賴性及時間依賴性漁藥, 藥物濃度必須達到一定峰值及持續一定時間, 才足以殺滅致病菌[16]. 而如果養殖戶每天低劑量拌料, 即使達到一定濃度但持續天數不足, 都會影響藥性的發揮.

在寧波市主要養殖品種流行病學調查工作的基礎上, 對常見病原菌進行耐藥性分析, 初步了解重要病原菌的耐藥性及其變化規律, 為規范使用漁用抗菌藥提供基礎數據, 促進水產品質量安全水平的逐步提高. 通過藥敏試驗等技術手段達到精準用藥, 減少用藥, 促進漁業轉型升級和高質量綠色發展.

[1] 寧波市海洋與漁業研究院. 寧波市水產病害防控與安全科技創新團隊[Z]. 2016.

[2] 李小平, 萬曉媛, 張慶利, 等. 2016~2017年中國沿海省市蝦類偷死野田村病毒(CMNV)分子流行病學調查[J]. 漁業科學進展, 2019, 40(2):65-73.

[3] 陳瑜, 李勇, 馮龍, 等. 2019年泗陽縣運河北片魚類寄生蟲性疾病流行病學調查報告[J]. 漁業致富指南, 2020 (2):64-67.

[4] 王姝, 徐立蒲, 王小亮, 等. 北京地區2007~2015年鯉春病毒血癥病毒感染流行病學研究[J]. 病毒學報, 2017, 33(4):593-597.

[5] Moreno C, Romero J, Espejo R T. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus[J]. Microbiology, 2002, 148:1233-1239.

[6] 吳玉婷, 廖金軒, 龐茂達, 等. 大黃魚中哈維氏弧菌毒力及耐藥特性分析[J]. 食品安全質量檢測學報, 2019, 10(8):2111-2119.

[7] 許悅, 王印庚, 周永燦, 等. 海南地區養殖石斑魚皮膚潰瘍病病原的分離、鑒定、藥敏分析及病理學研究[J]. 海南大學學報, 2018(2):153-163.

[8] 陳建國, 陳超, 李炎璐, 等. 美洲黑石斑魚()“突眼癥”的病原菌分離鑒定[J]. 漁業科學進展, 2017(5):32-40.

[9] 張飛, 蘇永全, 王軍, 等. 大黃魚()源美人魚發光桿菌()的分離鑒定及致病性研究[J]. 海洋與湖沼, 2012, 43(6):1202- 1208.

[11] 丁慶秋, 汪應文. 一例加州鱸魚感染微孢子蟲病例[J]. 當代水產, 2018(10):81.

[12] 施慧, 謝建軍, 汪瑋, 等. 養殖大黃魚“白腮病”一種新病毒病原的初步研究[J]. 水產學報, 2017(9):1455- 1463.

[13] 施慧, 陳卓, 丁慧昕, 等. 養殖大黃魚一種粘孢子蟲病的組織病理學及檢測方法初探[J]. 中國水產科學, 2019 (1):203-213.

[14] 王建平, 斯烈鋼, 余曉魏, 等. 寧波市大黃魚主要病害流行情況及對策[J]. 科學養魚, 2008(10):48-49.

[15] 賀文旭, 毛會麗, 楊利敏, 等. 豫北地區主要淡水魚類感染嗜水氣單胞菌的流行病學調查[J]. 水產科學, 2016, 35(3):278-283.

[16] 魏志宇, 曲玉虎. 細菌性魚病的藥敏試驗與用藥效果存在差異的原因分析[J]. 漁業致富指南, 2017, 15:53- 54.

Epidemiology and drug sensitivity test of main aquaculture marine fish in Ningbo city in 2020

XU Shengwei, GE Mingfeng*, XU Haochuan, WANG Wenqiong, SHEN Weiliang

( Ningbo Ocean and Fisheries Research Institute, Ningbo 315042, China )

In order to understand the disease occurrence of aquaculture species in Ningbo city, this study carried out an epidemiological study about local main marine fish via regular sampling and emergency testing in 2020. A total of nineteen strains of bacteria were separated from,,,and other marine fish. The main strains wereand. A total of twenty-six batches of viruses were tested positive. The vast majority of virus was infectious spleen and kidney necrosis virus and Red sea bream iridovirus. Two cases of parasites were observed by microscope. They wereGussev andrespectively. The results of drug susceptibility test showed that the majority of the pathogenic bacteria isolated from fish were sensitive to doxycycline hydrochloride and flumequine. The minimum inhibitory concentration of these two drugs was generally lower than 0.1mg?L-1, so they are suggested to be used as preferred drugs for the treatment of bacterial diseases. In addition, it showed that the susceptibility to drugs of the same bacteria isolated fromin different time was inconsistent. The results of drug susceptibility test will help fishermen to apply drug scientifically and accurately. At the same time, the results can provide theoretical basis for the general survey of drug susceptibility of pathogens in local aquaculture animals.

marine fish; disease; epidemiology; drug susceptibility test

S917.1

A

1001-5132（2021）02-0109-06

2020?10?29.

寧波大學學報（理工版）網址: http://journallg.nbu.edu.cn/

現代農業產業技術體系專項基金（CARS-47-Z08）.

徐勝威（1983－）, 男, 浙江蘭溪人, 碩士/工程師, 主要研究方向: 水生動物病害防控. E-mail: 546207546@qq.com

葛明峰（1988－）, 男, 浙江寧波人, 碩士, 主要研究方向: 水生動植物病害防治. E-mail: 910342950@qq.com

（責任編輯 章踐立）