LncRNA SNHG11對高糖誘導的人視網膜色素上皮細胞上皮間質轉化及增殖、遷移的影響

楊靜 楊堃2 孟旭霞 王一博

(青島大學附屬醫院，山東 青島 266500 1 眼科； 2 中心實驗室)

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病最常見、最嚴重的微血管并發癥，在世界范圍內因DR導致視力受損或喪失的患者正在逐年增加[1-2]。DR的病理機制與高血糖對視網膜微血管組織的影響有關[3]。高血糖可導致多元醇代謝途徑異常、晚期糖基化終末產物(AGEs)積累、蛋白激酶C(PKC)激活、氧化應激增強、細胞因子失衡[4]。多種因素相互作用，使得內皮細胞和視網膜色素上皮細胞(RPE)分別建立的內層及外層血視網膜屏障(BRB)功能受損，加速DR的進展。

長鏈非編碼RNA(LncRNAs)是一類長度超過200個核苷酸的RNA，由于缺乏完整的開放閱讀框(ORF)而無蛋白質編碼功能，但可通過多種不同的機制參與蛋白質編碼基因和表觀遺傳基因的表達調控[5]。近年來LncRNA在眼部疾病發生發展中的作用及其機制受到越來越多的關注。小核仁宿主基因11(SNHG11)是一種新發現的LncRNA，被認為是前列腺癌和卵巢癌的預后標志物[6]。也有研究證實SNHG11作為膠質瘤的癌基因，可通過調節上皮-間質轉化(EMT)來抑制細胞的增殖、侵襲以及遷移[7]。但目前尚未有研究SNHG11與DR關系的報道。

EMT是完全極化的細胞通過基底表面進入基底膜的生理或病理過程，經歷多種形態和功能的改變，從而獲得間質表型[8]。當機體在炎癥、傷口愈合和癌變等病理情況下EMT可被激活，此時細胞的遷移、侵襲及抗凋亡的能力增強[9]。既往研究表明，高血糖誘導培養的RPE可發生EMT[10]。本研究旨在探討SNHG11在高糖誘導的ARPE-19細胞EMT及增殖、遷移中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

ARPE-19 細胞購買于武漢生物細胞庫，普通DMEM培養基、高糖型DMEM培養基以及胎牛血清、胰蛋白酶、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒均購買于大連美侖生物技術有限公司。熒光定量PCR試劑盒、細胞裂解液、反轉錄試劑盒以及TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自日本TaKaRa 公司。熒光定量PCR所用引物由華大基因合成，Si-SNHG11由上海吉瑪基因化學技術有限公司設計合成,脂質體LipofectamineTM3000購自美國 Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞處理及分組 RPE系ARPE-19細胞常規培養于含體積分數0.10胎牛血清DMEM/F12培養基中，置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的恒溫箱中培養。每1～2 d換一次新鮮培養液，細胞融合至90%左右時，胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期的細胞進行分組并給予不同條件進行處理。低糖對照組：用5.5 mmol/L葡萄糖處理48 h；高滲對照組：使用60.0 mmol/L甘露醇處理48 h；高糖干預組：使用60.0 mmol/L的葡萄糖處理48 h；si-NC組：將si-conSNHG11轉染至ARPE-19細胞以后，使用60.0 mmol/L的葡萄糖處理48 h；siSNHG11組：將siSNHG11轉染至ARPE-19細胞以后，再使用60.0 mmol/L葡萄糖處理48 h。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測各組細胞SNHG11的表達 各組細胞按分組條件培養48 h后提取總RNA，再反轉錄成cDNA。按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR，每個樣品設3個復孔，反應總體系為20 μL。循環條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共進行40個循環。以GAPDH為內參照。GAPDH上游引物序列5′-CA-AAACAGCCTCAAGATCATCA-3′，下游引物序列5′-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′。定量分析結果以熒光強度(CT)值表示，待測基因表達水平以GAPDH作為參比，待測基因的相對表達量用2-△△CT計算，實驗重復3次，取均值。

1.2.3Western blot實驗檢測各組細胞EMT標記物蛋白的表達 各組細胞按分組條件培養48 h后，收集細胞，提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，加入5×Loading buffer以后高溫加熱10 min使蛋白變性。按照SDS-PAGE凝膠試劑盒說明書配置150 g/L的分離膠及50 g/L的濃縮膠，電泳、轉膜，以50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，再分別加入一抗 E-鈣黏蛋白(E-cad)、緊密連接蛋白(ZO-1)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，4 ℃孵育過夜，Tris鹽吐溫緩沖液(TBST)洗膜。加入二抗室溫孵育90 min，TBST洗滌3次，ECL化學發光液顯像，使用Image J軟件分析各組蛋白條帶的灰度值。蛋白相對表達量=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值，結果取3次重復實驗的均值。

1.2.4CCK8實驗檢測細胞活力 將生長狀態良好、處于對數期的ARPE-19細胞接種于96孔板中,待細胞密度達到40%～60%時，將細胞按實驗要求分為低糖對照組、高滲對照組、高糖干預組、si-NC組、si-SNHG11組，各組細胞按分組條件培養48 h后，分別加入5 g/L CCK8溶液20 μL，37 ℃培養箱中孵育4 h，吸去培養液。酶標儀檢測490 nm波長處吸光度(A)值，細胞存活率=(A實驗組/A對照組)×100%，結果取3次重復實驗的均值。

1.2.5細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將生長狀態良好、處于對數期的ARPE-19細胞接種于6孔板中,待細胞密度達到40%～60%時，使用無菌200 μL移液槍頭垂直于培養板底畫“一”字水平劃痕,形成一個無細胞區,PBS洗滌3次去除離壁漂浮的細胞,將細胞按實驗要求分為低糖對照組、高滲對照組、高糖干預組、si-NC組、si-SNHG11組，每組細胞設3個復孔，在培養后第0、48 h使用倒置相差顯微鏡拍照，采用Image J圖像分析軟件分別測量初始無細胞區面積與當前無細胞區面積，細胞相對遷移面積=(初始無細胞區面積-當前無細胞區面積)/48 h無細胞區面積×100%。

2 結 果

2.1 各組ARPE-19細胞中SNHG11基因相對表達量變化

低糖對照組、高滲對照組以及高糖干預組SNHG11基因相對表達量比較差異具有統計學意義(F=44.27，P<0.01)；低糖對照組與高滲對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；高糖干預組SNHG11相對表達量顯著高于低糖對照組、高滲對照組(t=7.86、6.19，P<0.05)。si-SNHG11組中SNHG11基因相對表達量與si-NC組比較顯著升高(t=18.62，P<0.01)。見表1。

2.2 各組ARPE-19細胞相對遷移面積比較

低糖對照組、高滲對照組、高糖干預組相對遷移面積比較差異均具有統計學意義(F=9.14,P<0.05)；高糖干預組48 h的相對遷移面積顯著高于低糖對照組、高滲對照組(t=3.99、2.96，P<0.05)；低糖對照組與高滲對照組進行比較差異無顯著性(P>0.05)。si-SNHG11組48 h的相對遷移面積顯著小于si-NC組(t=10.09，P<0.05)。見表1。

2.3 各組ARPE-19細胞存活率比較

低糖對照組、高滲對照組、高糖干預組細胞存活率相比差異具有統計學意義(F=7.71，P<0.05)；高糖干預組細胞存活率顯著高于低糖對照組、高滲干預組(t=3.18、4.74，P<0.05)；低糖對照組與高滲對照組進行比較差異并無顯著性(P>0.05)。si-SNHG11組細胞存活率顯著低于si-NC組，差異具有顯著性(t=5.37，P<0.05)。見表1。

表1 各組SNHG11相對表達量、相對遷移面積、細胞存活率比較

2.4 各組ARPE-19細胞中EMT標志物的蛋白表達量比較

低糖對照組、高滲對照組、高糖干預組E-cad、ZO-1、Vimentin、α-SMA的表達量比較差異均具有顯著性(F=5.48～124.41，P<0.05)；高糖干預組中Vimentin、α-SMA的表達量顯著高于低糖對照組、高滲對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)；低糖對照組與高滲對照組相比，Vimentin、α-SMA的表達量無明顯差異(P>0.05)。高糖干預組中E-cad、ZO-1的表達量顯著低于低糖對照組、高滲對照組(P<0.05)；低糖對照組與高滲對照組相比，E-cad以及ZO-1的表達量并沒有明顯的差異(P>0.05)。

si-SNHG11組中E-cad及ZO-1的表達量顯著高于si-NC組(t=3.15、3.34，P<0.05)；同時Vimentin以及α-SMA的表達量顯著低于si-NC組(t=3.30、13.44，P<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組EMT標志物蛋白表達量比較

A、B、C、D、E分別為低糖對照組、高滲對照組、高糖干預組、 si-NC組、si-SNHG11組

3 討 論

RPE細胞是視網膜神經上皮層與脈絡膜毛細血管層之間含有黑色素的單層多邊形上皮細胞，具有極為重要的生理功能，特別是作為外層BRB，在DR的發病中發揮著至關重要的作用[11]。目前，在DR發病機制的基礎研究方面，RPE細胞的研究相對于視網膜內皮細胞及周細胞仍較少。ARPE-19細胞是目前最常用的人RPE細胞系，保持了RPE良好的特性。因此，本研究將ARPE-19細胞作為研究對象進行相關的研究。

當機體在正常生理狀態下時，RRE細胞通常處于靜止狀態，當發生炎癥、衰老或損傷等情況時，RPE細胞可經歷上皮細胞向間質細胞轉變的過程，細胞間的緊密連接被破壞，細胞發生遷移并聚集到鄰近的組織或器官[12-15]。以往的實驗研究顯示，體外培養的RPE細胞可在生長因子TGF-β1、EGF或CTGF的作用下發生EMT[16-17]。最近的研究發現，高糖也可誘導ARPE-19細胞系的EMT，這可促進纖維化因子的上調以及BRB的破壞[18]。RPE細胞間的緊密連接對BRB的穩定性起著至關重要的作用，在糖尿病實驗模型中已經證實ZO-1表達水平的降低可引起BRB的破壞[19]。BRB完整性的保持也是由于緊密連接和黏附連接之間相互作用的結果，這種相互作用由細胞和細胞黏附分子介導，如E-cad[20]。本研究利用高糖刺激ARPE-19細胞建立高糖模型，并通過Western blot檢測EMT相關標記物。實驗結果顯示，上皮細胞標記物E-cad、ZO-1顯著下調，間質標志物Vimentin、α-SMA顯著上調，證實高糖可誘導ARPE-19細胞的EMT。劃痕實驗以及CCK8實驗結果顯示，高糖誘導的ARPE-19細胞的遷移以及增殖能力均顯著增強，這與CHE等[10]的研究結果一致。

近年來，LncRNA在視網膜疾病發生發展中的作用受到越來越多的關注，到目前為止，已發現幾種LncRNA與常見視網膜疾病有密切關聯[21-22]。已證實LncRNAMALAT1在增殖性玻璃體視網膜病變中促進RPE細胞增殖、遷移以及視網膜前膜形成[23-24]。LncRNAMIAT在糖尿病視網膜病變中促進內皮細胞的增殖和遷移[25]。SNHG11作為新發現的LncRNA，已在多種腫瘤的發病機制中得到廣泛研究，包括肺癌[26]、結直腸癌[27]、腎癌[28]等。目前，尚無關于SNHG11在DR中相關作用的報道，本研究結果首次證明了SNHG11在高糖誘導的ARPE-19細胞EMT中發揮了重要作用。

本研究結果顯示，高糖誘導的ARPE-19細胞中SNHG11的表達顯著上調，利用小干擾RNA敲低SNHG11以后，ARPE-19細胞中上皮細胞標記物E-cad、ZO-1顯著上調，間質標志物Vimentin及α-SMA顯著下調，ARPE-19細胞的增殖及遷移能力均下降，EMT發生逆轉。由此猜測SNHG11是通過激活EMT的相關信號促進了高糖誘導的ARPE-19細胞的增殖和遷移。GENG等[7]研究也發現，SNHG11作為膠質瘤的癌基因，通過調控miR-154-5p促進膠質瘤細胞發生EMT。因此，推測SNHG11可能是通過靶向調控miR-154-5p促進高糖誘導的ARPE-19細胞的EMT，但具體機制仍需進一步研究探討。

眾所周知，當細胞發生EMT時，其遷移、增殖及抗凋亡的能力增強[29]。RPE細胞不受控制的增殖和遷移可導致神經視網膜表面纖維增生性前膜的形成，BRB被破壞，繼而發生視網膜水腫、脫離或變性，最終導致視力損害[30-31]。此外，纖維增生性前膜的形成也是增生性DR的主要特征[32]。及時抑制RPE細胞增殖、遷移對保護BRB至關重要。本研究發現敲低SNHG11可逆轉高糖誘導的ARPE-19細胞的EMT，阻止細胞的增殖和遷移，但此研究結果僅限于細胞水平，后續的體內實驗及具體分子機制還需進一步研究。

綜上所述，LncRNASNHG11參與了高糖誘導的ARPE-19細胞EMT的過程，從而促進了細胞的增殖和遷移，敲低SNHG11可逆轉ARPE-19細胞的EMT，從而抑制細胞的增殖以及遷移，提示SNHG11在DR的發病過程中發揮著重要的作用。本研究結果為LncRNA在DR的預防和治療中發揮調控作用提供了更多的實驗室依據。