骨肉瘤診療相關生物標記物研究進展

鄭來 韓旭 李宏倬

【摘要】 全世界青少年和兒童都受到骨肉瘤的威脅，這種腫瘤主要好發于長骨干骺端，是該年齡段最常見的高度惡性骨腫瘤。早期腫瘤檢測是有效治療該疾病的關鍵，生物標志物的發現和對分子及其復雜相互作用的不斷認識改善了骨肉瘤臨床試驗結果。本文簡述了骨肉瘤的生物標志物，并重點介紹了骨肉瘤相關生物標志物的研究進展，以期對骨肉瘤臨床治療的進展產生積極影響。

【關鍵詞】 骨肉瘤 化療 治療 惡性骨腫瘤 生物標志物

Research Progress of Biomarkers Related to Diagnosis and Treatment of Osteosarcoma/ZHENG Lai， HAN Xu， LI Hongzhuo. //Medical Innovation of China， 2021， 18（27）： -172

[Abstract] Adolescents and children all over the world are threatened by osteosarcoma， this tumor mainly occurs in the epiphysis of the long shaft， it is the most common highly malignant bone tumor in this age group. Early tumor detection is the key to the effective treatment of this disease. The discovery of biomarkers and the continuous understanding of molecules and their complex interactions have improved the results of clinical trials of osteosarcoma. This paper briefly describes the biomarkers of osteosarcoma， and focuses on the research progress of osteosarcoma related biomarkers， in order to have a positive impact on the progress of clinical treatment of osteosarcoma.

[Key words] Osteosarcoma Chemotherapy Treatment Malignant bone tumor Biomarkers

First-author’s address： Graduate School of Changzhi Medical College， Changzhi 046000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.27.042

骨肉瘤是于1807年在“波耶爾講座”首次提出的一種骨骼疾病。好發于20歲以下的兒童和青少年，男性發病率高于女性，每百萬人約有8.7人患有骨肉瘤，是該年齡組中最常見的惡性骨腫瘤[1]。骨肉瘤多發于長骨干骺端（股骨遠端43%，脛骨近端23%，肱骨近端10%）[2]，因此其主要癥狀包括患處腫脹、關節疼痛及活動受限。病理檢查可提供明確的診斷及腫瘤分級信息。骨肉瘤大多數早期發生肺部轉移，與肺轉移患者相比，未轉移患者五年生存率更高。新輔助化療以及手術切除已經將此類患者5年生存率由1970年之前的10%提高到50%～70%。骨肉瘤的異質性是影響治療效果的主要原因。生物標記物可用于診斷骨肉瘤患者，特別是骨肉瘤發生轉移患者，生物標記物可能是早期診斷骨肉瘤以及確定潛在治療靶點的有效途徑。因此，本文針對這一方向綜述了骨肉瘤細胞實驗、動物模型及組織學標本中生物標記物的研究。

1 MicroRNA

MicroRNA或miRNA是高度保守、內源性、受到嚴格調控的非編碼小RNA（18～25個核苷酸），通過直接降解或抑制翻譯來靶向抑制mRNA轉錄。其主要在細胞凋亡、分化以及細胞周期等多項生物學過程中發揮作用，其表達受到表觀遺傳學（如DNA甲基化、組蛋白去乙酰化及其他轉錄調控機制）的嚴格調控。

miRNA可抑制癌基因或抑癌基因的表達，而這些基因在腫瘤發生過程中起著重要作用。以骨肉瘤為例，多個研究報道了不同miRNA在細胞系或樣本中的表達譜[3]，例如miR-195、miR-99、miR-181及miR-148a在骨肉瘤中表達上調，而其他如miR-539、miR-145及miR-335在MG-63人類骨肉瘤細胞系中表達下調。

Cai等[4]進行了一項關于miRNA作為骨腫瘤標志物作用的研究，他們通過實時定量RT-PCR試驗發現骨肉瘤患者血清中的miR-195水平低于正常對照組，表明miRNA具有作為骨肉瘤標志物的潛在可能，其可有效用于骨肉瘤的篩查與監測。Zhou等[5]進行的一項研究表明，血清miR-199a-5p在骨肉瘤樣本中濃度較高。Ouyang等[6]測量了6個miRNA（miR-21、miR-199a-3p、miR-143、miR-34、miR-140和miR-132）的表達水平，發現miR-21在骨肉瘤患者中表達水平較高，而miR-199a-3p和miR-143在骨肉瘤患者中表達水平較低。

2 細胞因子

細胞因子是由單核細胞和巨噬細胞等分泌的小蛋白質，其是宿主對創傷、感染和免疫反應的調節因子。血漿中促炎細胞因子的異常升高與肥胖、2型糖尿病、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎和癌癥有關。多項研究表明與健康對照相比，骨肉瘤患者的轉化生長因子（TGF-β）水平升高[7]。Tu等[8]的一項研究發現骨肉瘤細胞刺激間充質干細胞（MSCs）產生促腫瘤細胞因子的分泌，他們通過Saos-2和U2骨肉瘤細胞株的培養基刺激了MSCs中IL-6和血管內皮生長因子（VEGF）的產生，而TGF-β抗體可以中和這種作用。目前，抑制TGF-β的藥物也已用于臨床前研究和臨床試驗。而VEGF也被觀察到在包括骨肉瘤在內的多種類型的癌癥中上調，其參與骨肉瘤的血管生成，已被用作骨肉瘤患者預后的生物標志物。此外，VEGF的表達也與總生存率和無病生存率有關，VEGF表達高的患者無病生存率及總體生存率較低，這表明VEGF可能作為骨肉瘤預后的有效生物標志物。

Zhu等[9]研究了骨肉瘤患者細胞因子水平，他們發現，與正常對照組相比，試驗組中包括ILS-6、TGF-β、生長相關癌基因、肝細胞生長因子、趨化因子配體16、內切蛋白酶、基質金屬蛋白酶-9和血小板衍生生長因子-AA在內的21種細胞因子上調，并通過酶聯免疫吸附（ELISA）試驗得到證實，其中已知間充質干細胞分泌ILS-6可以促進骨肉瘤增殖和轉移[10]。在另一項研究中，通過對骨肉瘤患者血清的免疫測定，發現β-異構化C端末端肽（β-CTx）和總1型前膠原氨基末端肽（tP1NP）顯著升高。因此認為，這些蛋白質可以作為骨肉瘤生物標志物[11]。

TIM3表達異常與多種癌癥有關，其屬含有T細胞免疫球蛋白和粘蛋白結構域的分子（TIM）家族，并由包括T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和自然殺傷細胞等在內的多種免疫細胞表達。Shang等[12]發現TIM3也在人類骨肉瘤細胞系中表達。此外，TIM3還被發現與已在骨肉瘤患者中檢測到的Slug、Snail和Smad共表達。因此，TIM3有望作為診斷和治療骨肉瘤的工具。

基質金屬蛋白酶（MMPs）屬于鋅依賴性內肽酶家族，由巨噬細胞和中性粒細胞分泌，參與包括細胞外基質（ECM）降解和重構、形態形成、創面愈合、組織修復和重塑等多種生理和病理過程。此外，MMPs通過激活細胞生長、遷移、侵襲、轉移和血管生成在腫瘤進展中發揮關鍵作用。一項研究表明在亞洲和非亞洲人群中，MMP-9的表達與骨肉瘤風險之間存在顯著相關性[13]。

半乳糖凝集素是凝集素家族的β-半乳糖苷結合蛋白，其與細胞遷移，凋亡和分化等細胞過程有關。在這個家族的成員中，半乳糖凝集素1和3與胰腺癌、乳腺癌和胃癌以及骨肉瘤等癌癥有關。Zhou等[14]的一項研究中發現骨肉瘤患者的血清半乳糖凝集素3水平高于正常對照組，并且在癌癥晚期該蛋白水平越來越高。類似地，Lei等[15]的研究中發現半乳糖凝集素3在骨肉瘤組織和細胞系中過表達，敲除半乳糖凝集素3可抑制骨肉瘤細胞系的生長、遷移和侵襲。Park等[16]報告了類似的結果，他們證實半乳糖凝集素3的沉默導致骨肉瘤遷移和侵襲減少，這與侵襲介質（如Lyn、β-連環蛋白和Src）的表達減少有關。與半乳糖凝素3相似，通過敲除絲裂原活化蛋白激酶途徑中的半乳糖凝集素1，可抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲特性。這些發現證實了半乳糖凝集素1和3作為骨肉瘤生物標志物的作用，并且其表達水平可能與疾病的進展相關。

3 乳酸脫氫酶

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）可催化糖酵解途徑中丙酮酸和乳酸的相互轉化，是包括骨肉瘤在內的多種癌癥預后的生物標志物。Chen等[17]的研究表明，血清高LDH水平與骨肉瘤患者總生存率較低有關。Li等[18]研究發現乳酸脫氫酶B亞基（LDHB）在胚胎干細胞系中高度表達。相反，敲除LDHB導致這些細胞系的增殖、遷移和侵襲減少。與無遠處轉移的患者相比，在有遠處轉移、復發或晚期的骨肉瘤患者骨組織中檢測到更高水平的LDHB基因。這些結果表明，LDHB有可能作為骨肉瘤的一個預后指標。

4 Ezrin蛋白

Ezrin屬于（ezrin/radixin/moesin，ERM）蛋白家族，起連接質膜和細胞骨架的作用，在組織細胞表面結構黏附、遷移中起重要作用。多項研究表明Ezrin的表達與腫瘤轉移有關。在骨肉瘤中，Ezrin的表達與肺轉移有關，抑制Ezrin可減少肺轉移的發生。Park等[19]的研究發現所有低分化腫瘤患者都存在Ezrin高表達。Li等[20]分析發現Ezrin的表達與骨肉瘤的復發和存活率低相關。表明Ezrin可能是骨肉瘤患者預后的有效標志。

5 其他蛋白標記

脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶/氧化還原因子-1（APE1）是另一種可能用于預后的生物標志物，參與DNA堿基切除修復途徑，在細胞凋亡和細胞周期中起作用，并調節其他轉錄因子（如HIF、NF-κB和p53）的表達。研究發現APE1的高表達與骨肉瘤患者生存期的縮短相關。

缺氧也可導致環氧合酶-2（COX-2）表達的激活。已有研究表明COX-2過表達促進了骨肉瘤的發生。此外，COX-2的表達與骨肉瘤患者的疾病特異性生存率呈負相關。COX-2抑制劑塞來昔布可以抑制細胞增殖并誘導人骨肉瘤細胞凋亡，這進一步證實了COX-2在骨肉瘤中的作用。一項Meta分析收集了來自14項研究的765例患者，分析了COX-2與腫瘤轉移、臨床分期和3年總生存率之間的關系，結果發現COX-2的高表達與腫瘤轉移及臨床晚期相關，提示COX-2可能是骨肉瘤的備選生物標志物[21]。Chen等[22]的一項研究證實了化療前經病理活檢后HIF-1、APE1、VEGF和COX-2蛋白表達之間的關系，并確定其預后價值。有研究通過免疫組織化學檢測發現HIF細胞與COX-2、VEGF和APE1相關。

Src蛋白也屬于在骨肉瘤發展和進展中有前景的生物標志物。骨肉瘤中，Src蛋白通過多種信號途徑被激活成為磷酸化Src，在不同的細胞過程（如細胞存活、黏附和遷移）中發揮重要作用。Hu等[23]研究了Src在骨肉瘤患者中的表達，發現Src過度表達與骨肉瘤肺轉移有關，并表明預后不良。Urciuoli等[24]發現了Src細胞定位在確定骨肉瘤預后中的重要性，強細胞核染色預示著預后良好，而強細胞質染色與預后不良相關。

Skoda等[25]研究發現Hedgehog蛋白可以調節骨肉瘤的進展，并影響骨肉瘤的遠處轉移。Lo等[26]研究表明，高水平的Hedgehog信號傳導與高級別骨肉瘤的進展相關。關于Hedgehog信號傳導的治療潛力也有報道，例如，Hedgehog/Gli途徑抑制劑可以防止骨肉瘤的生成[27]。因此，抑制Hedgehog途徑可能是治療骨肉瘤的新途徑。

綜上所述，目前許多基礎、轉化和臨床研究已經報道了與骨肉瘤相關的生物標志物。基于這些研究，各種生物標志物可能被用于監測骨肉瘤的進展或預后。然而，目前很少有標志物能夠作為疾病早期確診指標。要成功地將生物標志物應用于臨床，還需要更多隨機對照臨床研究。

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（收稿日期：2021-01-07） （本文編輯：姬思雨）