2型糖尿病患者GCKR基因多態性及巨噬細胞STAT3蛋白表達的研究

褚 璐,任建華,于曉忠

(開灤總醫院趙各莊醫院，河北 唐山063101)

2型糖尿病(T2DM)占全部糖尿病患者數的90%左右，是由于機體存在胰島素抵抗(IR)導致血糖升高而形成的疾病[1-4]。T2DM的發病機制仍不清楚，不過其發病具有很強的家族聚集性。GKRP是糖異構酶家族成員，為一種不耐熱的化學分子蛋白質。GCKR可與肝臟中的葡萄糖激酶(GCK)結合成GKRP-GCK復合物，維持葡萄糖穩態，調節肝臟葡萄糖代謝和胰島素釋放，抑制GCK的活性[5-6]。GCKR的基因多態性位點rs780094的T等位基因與T2DM 發病風險的降低和血糖水平的降低有關[7]。巨噬細胞是機體發揮免疫調節的重要細胞之一，在外在因素的刺激下可分泌多種分子誘導免疫耐受，從而誘發相關疾病的發生[8]。信號傳導和轉錄激活因子(STAT)是一種脫氧核糖核酸結合蛋白，存在于胞質中，能進入細胞核與DNA結合，從而發揮調控基因轉錄的功能[9]。STAT3是STAT3蛋白家族的重要成員，阻斷小鼠巨噬細胞的STAT3可刺激機體產生高水平的炎性細胞因子，發揮促炎作用[10-11]。本文通過檢測T2DM患者GCKR基因多態性及巨噬細胞STAT3蛋白表達情況，希望為T2DM的免疫治療尋找新的途徑、靶點和藥物提供參考。現總結報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

采用回顧性的研究方法，研究時間為2014年5月到2018年2月，選擇在開灤總醫院趙各莊醫院內分泌科進行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)篩查的健康人156例(對照組)、T2DM患者56例(T2DM組)與血糖調節受損(IGR)患者120例(IGR組)，納入標準：醫院倫理委員會批準了此次研究；無嚴重的急慢性疾病、腎病及其他嚴重疾病；臨床資料完整；年齡20-75歲；患者簽署了知情同意書。排除標準：TIDM及繼發性糖尿病者；心、肝功能不良者；妊娠、哺乳期者；患急性感染性疾病者；腫瘤、心腦血管意外患者。

1.2 GCKR基因多態性檢測

所有入選者在晨起空腹取舒適體位，肘前靜脈無菌采血5-8 ml后，采用QIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒提取外周血淋巴細胞的DNA。使用DNA MAN軟件設計待測多態性位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物，rs780094 引物序列為：正向引物：5′-ACGTTGGATGAGGGCCCCAGTT-TTTTAGAC-3′，反向引物：5′-ACGTTGGATGCCCGGCCTCAACAAATGTAT-3′。探針和引物由大連TAKARA公司設計和提供，嚴格按照實驗說明進行操作。5 μl反應體系：2×Mix 2.5 μl，40×Mix Kit 0.115 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O 1.385 μl。PCR條件：40個循環，95℃ 10 min，92℃ 15 s，60℃ 1 min。擴增產物片段長度為186 bp。

1.3 Western blot檢測巨噬細胞STAT3蛋白表達情況

從患者的肘前靜脈血中收集單核細胞，與巨噬細胞進行共培養，37℃孵箱共培養48 h后收集細胞。裂解細胞，離心取蛋白，采用BCA法定量蛋白濃度，上樣SDS-PAGE膠，轉膜后，一抗稀釋兔抗鼠Stat3抗體(×1000，Santa Cruz公司)與鼠抗鼠β-Actin抗體(×1000，Santa Cruz公司)，使用人HRP標識的二抗稀釋液(×10000，北京中杉金橋公司)，放入自動顯像系統，曝光讀取。

所有入選者的血糖、血脂指標由檢驗科統一檢測(奧林巴斯全自動生化分析儀)，同時記錄所有入選者的性別、年齡、體質量指數等資料。

1.4 統計方法

2 結果

2.1 基本特征對比

三組入選者的性別、年齡、體質量指數等對比差異無統計學意義(P>0.05)，T2DM組的空腹血糖、LDL-C、TG值顯著高于對照組，HDL-C和TC值低于對照組，T2DM組的空腹血糖高于IGR組，對比差異都有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 GCKR基因型與等位基因分布

三組入選者的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(P>0.05)，rs780094位點的三種基因型CC、CT、TT和等位基因C、T在T2DM組、對照組、IGR組之間的頻率分布差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 三組入選者的基本特征對比

表2 三組入選者的rs780094位點基因型及等位基因分布對比(n)

2.3 STAT3蛋白表達量對比

T2DM組的巨噬細胞STAT3蛋白相對表達量高于對照組和IGR組，IGR組也高于對照組，對比差異都有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 三組STAT3蛋白表達量對比

2.4 相關性分析

采用二元logistics回歸模型，在校正了年齡、性別、體質量指數、血糖、血脂等混雜因素后，與C等位基因相比，T等位基因入選者T2DM患病OR值為0.992；與CC 基因型相比，攜帶CT、TT、CT+TT基因型的入選者T2DM患病OR值為0.872、0.983和0.911。見表3。

在T2DM患者中，在校正了年齡、性別、體質量指數、血糖、血脂后，GCKR rs780094的CT、TT基因型患者與CC基因型患者相比，T等位基因患者與C等位基因患者相比，巨噬細胞STAT3蛋白表達量顯著下降(P<0.05)。見表4。

表3 不同GCKR基因型入選者的T2DM患病風險

表4 T2DM患者GCKR基因型與巨噬細胞STAT3蛋白表達的相關性(n=56)

3 討論

全基因組關聯研究顯示T2DM的易感候選基因接近300種，但是尚無一種或幾種基因能解釋T2DM遺傳變異情況[12]。全基因組掃描顯示GCKR基因長27kb，定位于染色體2p23.2-3，包含19個外顯子和18個內含子。血糖降低可讓GKRP與GCK特異性地結合，使GCK在細胞核內保持失活狀態，促使血糖升高[13]。血糖升高可使GCK-GKRP 解離，促進肝糖原合成，導致血糖降低。特別是過量表達的GKRP與更多的GCK 于核內結合，可發揮調節糖代謝的作用[14]。GCKR的基因多態性位點rs780094，早期研究顯示GCKR rs780094位點的T等位基因與T2DM發病風險有一定的相關性[15]。本研究顯示兩組入選者的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(P>0.05)，rs780094位點的三種基因型CC、CT 、TT和等位基因C、T在T2DM組、對照組、IGR組之間的頻率分布差異無統計學意義(P>0.05)。相關研究顯示白種人群中，rs780094 T等位基因降低了T2DM發病風險；非裔人中rs780094 T等位基因與T2DM的相關性較小[16-17]。本次研究也表明兩者無顯著相關性，可能與我國人群遺傳因素、生活方式、飲食習慣及其交互作用有關。不過本研究顯示T2DM組的空腹血糖、LDL-C、TG值顯著高于對照組，HDL-C和TC值低于對照組，T2DM組的空腹血糖高于IGR組，對比差異都有統計學意義(P<0.05)。從機制上分析，GCK水平的升高伴隨著游離型和結合型的GCK的活性均升高，可使肝臟葡萄糖酵解通量增加、葡萄糖的利用增加，導致脂肪酸合成酶的表達上調，促進了糖原的合成，并且促進脂肪酰輔酶A轉變為LDL-C和TG[18]。為此有研究表明GCKR基因rs780094的T等位基因具有對空腹血糖濃度降低和對TG濃度升高的作用[19-20]。

STAT3的酪氨酸殘基磷酸化可形成同源或異源二聚體，轉移到細胞核內，調節與誘導基因表達[21]。巨噬細胞的STAT3激活能增加白介素-10的分泌而誘導免疫抑制，特異性地阻斷小鼠巨噬細胞的STAT3，能促進機體產生高水平的炎性細胞因子，刺激細胞毒T淋巴細胞的增殖。STAT3也可參與調節多種細胞凋亡抑制基因的表達，STAT3的活化能誘導其靶基因Survivin的表達，發揮抗腫瘤細胞凋亡的作用[22]。本研究顯示T2DM組的巨噬細胞STAT3蛋白相對表達量高于對照組和IGR組，IGR組也高于對照組(P<0.05)。相關研究也表明酪氨酸磷酸化可募集胞漿內的STAT3，從而誘發炎癥性疾病的發生[23]。

GCK是葡萄糖氧化過程中的限速酶，能感受葡萄糖水平，參與調控肝臟糖原合成和葡萄糖異生，調節胰島素分泌。GCKR能競爭性抑制葡萄糖與GCK 結合，從而抑制GCK 活性，使血糖水平升高。本研究二元logistics回歸模型顯示與C等位基因相比，T等位基因入選者T2DM患病OR值為0.992；與CC 基因型相比，攜帶CT、TT、CT+TT基因型的入選者T2DM患病OR值為0.872、0.983和0.911。當前也有研究表明rs780094AA基因型在T2DM患者和代謝綜合征患者中空腹血糖水平較其他基因型者低[24]。

巨噬細胞可以分泌多種炎性因子，其中JAK-STAT途徑目前被認為是細胞因子信號轉導的主要途徑，可參與調節細胞增殖、分化、凋亡等多種生命活動。STAT3蛋白不僅對于腫瘤細胞的直接作用，還能在腫瘤微環境中對血管新生以及免疫逃避起到抑制作用。本研究顯示GCKR rs780094的CT、TT基因型患者與CC基因型患者相比，T等位基因患者與C等位基因患者相比，巨噬細胞STAT3蛋白表達量顯著下降(P<0.05)。GCKR rs780094基因型對巨噬細胞STAT3蛋白表達量的影響機制還不明確。有研究顯示，STAT3是炎性反應的調節因子，炎癥因子也通過抑制巨噬細胞的免疫功能，特別是能抑制巨噬細胞的抗原呈遞能力。GCKR rs780094基因多態性可激活交感神經系統，從而減低STAT3活化狀態，使巨噬細胞增殖活性降低[25]。

綜上所述，T2DM患者可表現為GCKR基因多態性，可導致T2DM的患病風險發生變化，與巨噬細胞STAT3蛋白表達有顯著相關性，從而調節T2DM的發生與發展。