基于TCGA和GEO數據挖掘分析PRC1在肺腺癌中的表達及預后意義

劉細幫 胡旭鋼 唐夏莉 陳清勇

肺癌是全球發病率和死亡率最高的惡性腫瘤。肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）是肺癌最常見的病理亞型，患者5年平均生存率僅為15%[1-2]。盡管近年來診斷和治療方法不斷改進，但LUAD患者的總體生存率并未提高。因此，有必要尋找新的預后生物標志物，這不僅有助于改善個體化治療，還能為開發新的治療靶點提供參考。胞質分裂蛋白調節因子1（protein regulator of cytokinesis 1，PRC1）基因位于人體15號染色體上（15q26.1），編碼含有620個氨基酸的蛋白；屬于微管相關蛋白家族，參與細胞有絲分裂和細胞周期調控[3]。研究發現，PRC1 是乳腺癌[4]、膀胱癌[5]、肝細胞癌[6]和胃癌[7]等腫瘤的致癌因子，并且PRC1的表達與LUAD細胞的增殖、侵襲和凋亡相關，可能是LUAD潛在的治療靶點[8-9]。但目前PRC1對LUAD患者總體預后影響的相關研究較少。本研究旨在通過對公共數據庫的挖掘，分析PRC1 mRNA表達水平與LUAD患者總體預后的相關性，探討其作為LUAD預后標志物的可行性，為今后有關PRC1的機制研究提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 PRC1數據的獲取 33種腫瘤數據來自腫瘤免疫評估資源（tumor immune estimation resource,TIMER）數據庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/），通過 Diff Exp模塊檢索PRC1在腫瘤組織與正常對照組織中的表達情況。通過腫瘤基因圖譜（the cancer genome atlas,TCGA）數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）獲取 PRC1表達的RNASeq數據，獲得的數據中包含517例原發性LUAD患者和59例正常肺組織，其中504例LUAD患者記錄了生存數據，并以PRC1 mRNA表達的中位數分為高表達組和低表達組。利用基因表達綜合（gene expression omnibus,GEO）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）分別下載包含LUAD組織及正常對照組織或癌旁正常組織的基因表達譜芯片數據集GSE31210、GSE75037和 GSE68465，其中 GSE31210、GSE68465 數據集各包含226、362例LUAD患者完整的臨床資料以及生存信息，并以PRC1 mRNA表達的中位數分為高表達組和低表達組。同時，從人類蛋白質圖譜（human protein atlas,HPA）數據庫（https://www.proteinatlas.org/）獲取腫瘤以及正常對照組織中PRC1蛋白免疫組化染色數據。

1.2 基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）采用GSEA 4.0進行分析。根據TCGA數據庫中PRC1 mRNA表達的中位數分為高表達組和低表達組，以Hallmark基因集作為參考基因集，通過GSEA分析PRC1參與LUAD發展的可能機制，設置置換次數為1 000次，以P＜0.05、錯誤發現率（false discovery rate,FDR）＜0.25為顯著富集基因集。

1.3 統計學處理 采用R 3.6和GraphPad 8.0統計軟件。計量資料以表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗或配對t檢驗；多組比較采用單因素方差分析。生存曲線分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用log-rank檢驗。采用R軟件ROC的時間序列分析（timeROC）包繪制ROC曲線并計算AUC值。Cox回歸模型分析PRC1與LUAD患者總生存期（overall survival,OS）、無進展生存期（progression-free survival,PFS）的關系，并計算HR值及其95% CI。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤組織中PRC1 mRNA表達 在TIMER數據庫提供的33種腫瘤數據中，膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma,BLCA）、乳腺浸潤癌（breast invasive carcinoma,BRCA）、膽管癌（cholangiocarcinoma,CHOL）、結腸癌（colon adenocarcinoma,COAD）、食管癌（esophageal carcinoma,ESCA）、頭頸鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma,HNSC）、腎嫌色細胞癌（kidney chromophobe,KICH）、腎透明細胞癌（kidney renal clear cell carcinoma,KIRC）、乳頭狀腎細胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma,KIRP）、肝細胞肝癌（liver hepatocellular carcinoma,LIHC）、LUAD、肺鱗癌（lung squamous carcinoma,LUSC）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma,PRAD）、直腸腺癌（rectum adenocarcinoma,READ）、胃癌（stomach adenocarcinoma,STAD）、甲狀腺癌（thyroid car－cinoma,THCA）、子宮內膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC）17種腫瘤組織中PRC1 mRNA表達水平均高于正常對照組織，見圖1。

圖1 腫瘤組織中胞質分裂蛋白調節因子1（PRC1）表達

2.2 LUAD組織和正常對照組織中PRC1的表達 在TCGA數據庫和GSE31210數據集中，LUAD組織中PRC1 mRNA表達水平均明顯高于正常對照組織，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖2a-b。在GSE75037數據集中，LUAD組織中PRC1 mRNA表達水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2c。在HPA數據庫中，PRC1免疫組化染色結果顯示，PRC1蛋白在正常對照組織中弱表達，而在LUAD組織中強表達，見圖2d-e。

圖2 肺腺癌（LUAD）組織和正常對照組織中胞質分裂蛋白調節因子1（PRC1）的表達[a-b：腫瘤基因圖譜（TCGA）數據庫、GSE31210數據集中LUAD組織和正常對照組織中PRC1 mRNA表達水平比較，與正常對照組織比較，**P＜0.01；c：GSE75037數據集中LUAD組織和癌旁正常組織中PRC1 mRNA表達水平比較，與癌旁正常組織比較，**P＜0.01；d-e：正常對照組織和LUAD組織中PRC1蛋白表達的比較，免疫組化染色，×40]

2.3 PRC1 mRNA表達水平與LUAD患者臨床特征的關系 通過TCGA數據庫分析發現PRC1 mRNA表達水平與LUAD患者的年齡、M分期均無關（均P＞0.05），但與LUAD患者的性別、吸煙、T分期、N分期和TNM分期均有關（均P＜0.01），見表1。

表1 TCGA數據庫中不同臨床特征LUAD患者PRC1表達水平比較

2.4 PRC1 mRNA表達與LUAD預后的關系

2.4.1 PRC1 mRNA表達與OS和PFS的關系 在TCGA數據庫、GSE31210和GSE68465數據集中，通過Kaplan-Meier生存曲線分析發現，除GSE68465數據集中的PFS外，其余PRC1高表達組患者PFS和OS均差于低表達組（均 P＜0.05），見圖 3（插頁）。

圖3 胞質分裂蛋白調節因子1（PRC1）表達與總生存期（OS）和無進展生存期（PFS）的關系[a-b：腫瘤基因圖譜（TCGA）中PRC1高表達組與低表達組OS和PFS生存曲線比較；c-d:GSE31210數據集中PRC1高表達組與低表達組OS和PFS生存曲線比較；e-f:GSE68465數據集中PRC1高表達組與低表達組OS和PFS生存曲線比較]

2.4.2 影響LUAD患者預后的臨床特征分析 在TCGA數據庫中，ROC曲線模型的OS顯示，1、3、5年生存率AUC值分別為0.674、0.632、0.590；ROC曲線模型的PFS顯示，1、3、5年生存率 AUC 值分別為 0.611、0.583、0.506，見圖4a-b。單因素Cox回歸分析結果顯示LUAD患者的性別、年齡和吸煙與OS均無關（均P＞0.05），但T分期、N分期、TNM分期和PRC1 mRNA表達水平與OS均有關（均P＜0.05）；單因素Cox回歸分析結果顯示LUAD患者的性別、年齡、TNM分期和吸煙與PFS均無關（均P＞0.05），但T分期、N分期和PRC1 mRNA表達水平均與PFS均有關（均P＜0.05）。將以上所有單因素納入多因素Cox回歸分析顯示，T分期、N分期和PRC1 mRNA表達水平均是影響LUAD患者OS和PFS的獨立危險因素（均P≤0.05），見圖4c-f。

圖4 影響肺腺癌（LUAD）患者預后的臨床特征分析[a-b：腫瘤基因圖譜（TCGA）數據庫中總生存期（OS）和無進展生存期（PFS）的ROC曲線；c-d：TCGA數據庫中OS單因素和多因素Cox分析；e-f：TCGA數據庫中PFS單因素和多因素Cox分析]

2.5 GSEA識別與PRC1相關的信號通路 為了確定PRC1作用的潛在信號通路，在TCGA數據庫中，GSEA分析結果顯示，PRC1高表達樣本富集在有絲分裂紡錘體、G2M檢查點、E2F信號通路、DNA修復等基因集中，見圖5。

圖5 基因集富集分析（GSEA）識別與胞質分裂蛋白調節因子1（PRC1）相關的信號通路

3 討論

細胞周期是哺乳動物細胞生長和發育所必需的進化保守過程，因為細胞周期畸變是癌癥的標志[10]。PRC1被認為是細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）底物，在早期細胞分裂中，是維持紡錘體中段所需的微管相關蛋白[11-12]。細胞分裂是一個復雜的過程，涉及復雜的生化和細胞動力學因素[10]，而PRC1作為細胞分裂的關鍵蛋白，其表達異常可引起細胞分裂的紊亂。研究表明，PRC1的過表達通過調節Wnt信號通路促進肝癌細胞增殖和轉移，并與早期復發和患者預后不良相關[6]。敲除PRC1可顯著抑制胃癌細胞增殖，減少胃癌細胞克隆形成并抑制其侵襲和遷移[7]。但是，目前PRC1在肺癌的發生、發展機制方面的研究較少，尤其是與患者臨床預后生存及標志物篩查的研究鮮有報道。

本研究中，筆者通過對多個大樣本數據庫進行分析發現，PRC1的表達水平在包括LUAD在內的多種腫瘤組織中上調，LUAD組織中PRC1表達也明顯高于正常對照組織和癌旁正常組織；且免疫組化結果提示，LUAD組織中PRC1蛋白表達水平明顯高于正常對照組織。在TCGA數據庫和GSE68465數據集中，PRC1表達與腫瘤的T分期、N分期和TNM分期均有關，提示PRC1可能參與LUAD的進展。基于多個數據庫的生存分析結果，表明PRC1 mRNA表達水平與LUAD患者的PFS、OS呈負相關，其表達水平越高，LUAD患者預后越差。并且該結果與Bu等[13]研究結果類似，該研究發現在卵巢癌組織PRC1呈高表達，并且PRC1的表達與生存時間呈負相關。

單因素及多因素Cox回歸分析顯示，T分期、N分期和PRC1 mRNA表達水平均是影響LUAD患者的獨立危險因素。為了進一步探討PRC1在LUAD中的潛在功能，GSEA分析結果表明，在有絲分裂紡錘體、G2M檢查點、E2F信號通路、DNA修復等通路高度富集。G2M檢查點能在DNA損傷的情況下阻止細胞周期，使細胞在進入下一個細胞周期階段前修復DNA損傷，從而維持基因組完整性[14]。因此，PRC1過表達時可能通過影響細胞周期和DNA修復，從而促進LUAD細胞的增殖分化。CDK-RB-E2F軸是細胞周期進程的核心轉錄機制，該軸的一個或多個關鍵組成部分的變化幾乎發生在所有腫瘤中，并導致致癌E2F活性增強，使腫瘤細胞增殖不受控制，進而導致腫瘤進展[15]。而PRC1作為CDK底物，過表達時可能促進該軸的轉錄，進一步增加E2F活性，導致腫瘤進展。由此可見，PRC1可能參與LUAD發生、發展過程，可能是LUAD治療的潛在靶點。

綜上所述，PRC1基因在LUAD中可能是一個潛在的致癌基因。PRC1在LUAD中的表達與腫瘤的發生、發展以及患者的預后有著非常密切的關系，可作為一個重要的候選生物標志物。因此，有必要對該基因在LUAD中的機制以及功能進一步研究，為全面掌握PRC1在腫瘤中的作用以及LUAD的預防診治提供更多依據。