綿羊Musclin基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)肌細(xì)胞糖代謝和胰島素作用的影響

鄭騰飛，辛 香，韓高鏈，李孟心，李俊玲，秦 健,2，杜 榮*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，太谷030801)

Musclin是Nishizawa等[1]于2004年在小鼠中首先發(fā)現(xiàn)的一種骨骼肌衍生分泌因子。其蛋白分子量為11 ku，包含130個(gè)氨基酸殘基，其N端存在一個(gè)包含30個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽。Musclin參與糖代謝，對(duì)胰島素刺激的葡萄糖攝取和糖原合成功能有抵抗作用[2-4]。Nishizawa等[1]在肥胖導(dǎo)致的胰島素抵抗KKAy小鼠的肌肉中觀察到MusclinmRNA的高表達(dá)。Zhang等[5]和Chen等[6]的研究結(jié)果也表明，Musclin與肥胖導(dǎo)致的胰島素抵抗等代謝性疾病有關(guān)。蛋白激酶B(AKT)[7-9]和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)[10-12]是糖代謝通路中重要的兩個(gè)因子。在胰島素信號(hào)通路中，Musclin能夠降低AKT的活性，從而使GLUT蛋白失活[2]。Musclin的表達(dá)與機(jī)體運(yùn)動(dòng)有關(guān)[13]。運(yùn)動(dòng)能夠改變Musclin的表達(dá)，延緩癌癥惡病質(zhì)小鼠的肌肉萎縮，也能通過(guò)升高M(jìn)usclin調(diào)控GLUT4的活性，改善高脂飲食喂養(yǎng)大鼠的脂質(zhì)代謝和胰島素敏感性[14-15]。然而，Musclin在葡萄糖代謝和胰島素抵抗中的作用機(jī)制目前尚不清楚，是否與糖代謝關(guān)鍵因子胰島素受體底物(IRS1)[16-17]和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)[18]的表達(dá)有關(guān)尚不清晰。而且，目前有關(guān)Musclin的研究大多以小鼠或大鼠為研究對(duì)象[19]，而針對(duì)大型哺乳動(dòng)物的研究報(bào)道很少。Chen和Gallo-Villegas等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)，人Musclin可通過(guò)紊亂葡萄糖代謝，導(dǎo)致胰島素抵抗發(fā)生。針對(duì)家畜，雖然有研究人員對(duì)兔[22]、牛[23]、豬[24]Musclin基因進(jìn)行了克隆和初步分析，但諸如糖代謝調(diào)節(jié)及其機(jī)制的深入研究鮮見(jiàn)報(bào)道。Li等[25]鑒定了能夠影響綿羊Musclin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要元件。但有關(guān)綿羊Musclin基因結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的生物信息學(xué)分析及對(duì)糖代謝和胰島素作用的影響尚未闡明。

本試驗(yàn)旨在利用生物信息學(xué)軟件分析和預(yù)測(cè)綿羊Musclin蛋白的結(jié)構(gòu)特征，為進(jìn)一步研究綿羊Musclin的生物功能提供依據(jù)。同時(shí)以綿羊成肌細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建和轉(zhuǎn)染綿羊Musclin基因真核表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)，研究綿羊Musclin基因?qū)φ；蛞葝u素刺激狀態(tài)下肌細(xì)胞糖代謝的影響及相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用，為揭示Musclin對(duì)綿羊肌肉發(fā)育的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為通過(guò)調(diào)控營(yíng)養(yǎng)代謝改善綿羊肌肉生長(zhǎng)性能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

Lipofectamine 2000 購(gòu)自Invitrogen 公司；D-MEM/F-12、新生牛血清、Pen Strep均購(gòu)自Gibco公司；胰酶、胰島素、FBS均購(gòu)于Sigma公司；馬血清購(gòu)自四季青公司；DL5000 DNA Marker、pMD18-T Vector、BamH I、XhoI、Trizol、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑、電泳用瓊脂糖、Real time PCR試劑和八連管均購(gòu)于TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒購(gòu)于OMEGA公司；EndoFree Plasmid Mini Kit購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)科技有限公司；60 mm培養(yǎng)皿、6孔 板、凍存管均購(gòu)于Corning公司；葡萄糖含量試劑盒和糖原含量試劑盒均購(gòu)自蘇州科銘；感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于山西賽奧生物科技有限公司；pcDNA3.1質(zhì)粒和綿羊成肌細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 綿羊Musclin生物信息學(xué)分析

利用表1中的生物信息學(xué)在線網(wǎng)站和軟件，對(duì)綿羊Musclin蛋白的結(jié)構(gòu)特征等進(jìn)行分析。

表1 生物信息學(xué)分析軟件

1.3 綿羊Musclin cDNA的克隆

根據(jù)綿羊MusclinCDS區(qū)，合成gBlock序列。根據(jù)NCBI中綿羊Musclin的基因序列(XM_004003038.4)，在NCBI上設(shè)計(jì)引物。產(chǎn)物總長(zhǎng)度為435 bp，其中上游引物序列(5′→3′)F:CAAGATCCGGAATTCGCCACCATGCTGGAC；下游引物序列(5′→3′)R:TCCTAGCCGCTCGAGTTAGCCTCTGGAATT。起始密碼子ATG前加kozak序列和酶切位點(diǎn)BamH I，終止密碼子端加酶切位點(diǎn)XhoI，兩端分別加上保護(hù)堿基。然后PCR擴(kuò)增、膠回收，并連接至pMD18-T載體上。將克隆載體37 ℃過(guò)夜搖菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定并測(cè)序。

1.4 綿羊pcDNA3.1-Musclin真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

對(duì)測(cè)序正確的克隆載體以及真核表達(dá)載體pcDNA3.1進(jìn)行BamH I-XhoI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳膠回收后連接構(gòu)建pcDNA3.1-Musclin真核表達(dá)載體。連接體系和反應(yīng)條件：pcDNA3.1 50 ng，目的基因Musclin50 ng，T4 DNA連接酶0.5 μL，10× T4 DNA連接酶緩沖液1 μL，補(bǔ)ddH2O至10 μL； 混勻后16 ℃過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞后挑選陽(yáng)性克隆，37 ℃過(guò)夜搖菌，提取質(zhì)粒，BamH I-XhoI雙酶切鑒定并測(cè)序。

1.5 綿羊成肌細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將本實(shí)驗(yàn)室保存的綿羊胎兒成肌細(xì)胞復(fù)蘇后，用含有10%新生牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染根據(jù)Lipofectamine 2000的說(shuō)明操作進(jìn)行：在轉(zhuǎn)染前1 d按照2.2×105個(gè)·孔-1的密度將細(xì)胞接種到6孔板。第2天，更換新鮮培養(yǎng)基800 μL，然后將2.5 μg質(zhì)粒與200 μL DMEM培養(yǎng)基或7 μL Lipofectamine 2000各自混勻并在室溫下孵育5 min，然后混合并繼續(xù)孵育20 min，加到更換新鮮培養(yǎng)液的以上貼壁細(xì)胞上，在37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞分組和處理方法

細(xì)胞共分為4組：空載體組(pcDNA3.1)、Musclin過(guò)表達(dá)組(pcDNA3.1-Musclin)、空載體+胰島素(80 nmol·L-1)組(pcDNA3.1 + Insulin)、Musclin過(guò)表達(dá)+胰島素(80 nmol·L-1)組(pcDNA3.1-Musclin + Insulin)。每組3個(gè)重復(fù)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染6 h后，更換為含2%馬血清的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，并根據(jù)分組方案添加胰島素或PBS。在48、72 h后收集培養(yǎng)液和細(xì)胞，用于后續(xù)檢測(cè)。

1.7 各處理組葡萄糖和糖原含量檢測(cè)

收取分化48和72 h時(shí)的培養(yǎng)液和細(xì)胞到2 mL 離心管。超聲波破碎細(xì)胞，離心取上清。調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀至特定波長(zhǎng)，測(cè)定之后，依照各試劑說(shuō)明書(shū)計(jì)算各組的葡萄糖和糖原含量。

1.8 各處理組RNA的提取及熒光定量PCR

用Trizol法(TaKaRa)提取綿羊成肌細(xì)胞的總RNA，并使用PrimeScriptTMRT試劑盒(Perfect Real Time，TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系：Mix 2 μL、RNA 4 μL、RNase Free ddH2O 4 μL。然后使用Power SYBR Green Kit(TaKaRa)在BIO-RAD定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因(表2)。

表2 內(nèi)參和目的基因引物序列

熒光定量擴(kuò)增體系為10 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)5 μL、Forward primer 0.4 μL、Reverse primer 0.4 μL、cDNA 1 μL、RNase-free water 3.2 μL；擴(kuò)增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè) 循環(huán)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)2-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。使用SPSS 19.0軟件單因素方差分析差異顯著性，所有數(shù)據(jù)均表示為“Mean±SD”。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。并使用GraphPad Prism 5軟件制作圖表。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊Musclin的生物信息學(xué)分析

2.1.1 綿羊Musclin蛋白的理化性質(zhì) 利用ProtParam在線網(wǎng)站對(duì)綿羊Musclin蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，計(jì)算出綿羊Musclin基因編碼132個(gè)氨基酸，分子式為C640H1048N188O189S4，預(yù)測(cè)分子量為14 528.75 u，原子總數(shù)為2 069。理論等電點(diǎn)為10.15，消光系數(shù)(280 nm)為0.757。不穩(wěn)定系數(shù)為42.12。脂肪系數(shù)為90.08，親水性平均系數(shù)為-0.234。

2.1.2 綿羊Musclin蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及其評(píng)估 通過(guò)SOPMA在線網(wǎng)站對(duì)綿羊Musclin蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，α-螺旋(α-helix) 有52個(gè)，占39.39%；β-折疊(β-sheet)有13個(gè)，占9.85%；β-轉(zhuǎn)角(β-turn)有8個(gè)，占6.06%；無(wú)規(guī)卷曲(random coil)有59個(gè)，占44.7%(圖1A)。應(yīng)用在線網(wǎng)站SWISS-MODEL預(yù)測(cè)綿羊Musclin結(jié)構(gòu)域區(qū)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)相吻合(圖1B)。利用SAVES在線網(wǎng)站評(píng)估模擬蛋白結(jié)構(gòu)的質(zhì)量(圖1C)。結(jié)果顯示，殘基在紅色區(qū)域[A,B,L]的比例為88.0%，在黃色區(qū)域[a,b,l,p]的比例為4.0%，在淺黃區(qū)域[～a,～b,～l,～p]的比例為4.0%，在白色區(qū)域的比例為4.0%。其中紅色區(qū)域中殘基的原子之間空間位阻最小。殘基在紅色區(qū)域的比例接近90%，說(shuō)明模擬的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)質(zhì)量較好。

圖A中，h為α-螺旋，e為β-折疊，t為β-轉(zhuǎn)角，c為無(wú)規(guī)卷曲。圖C中，黑色小斑點(diǎn)表示殘基，紅色區(qū)域?yàn)樽罴押侠韰^(qū)，黃色區(qū)域?yàn)檩^合適區(qū)，淺黃色區(qū)域?yàn)槊銖?qiáng)接受區(qū)，白色區(qū)域?yàn)椴缓侠韰^(qū) In figure A, h is α-helix, e is extended strand, t is β-turn and c is random coil; In figure C, the small black spots are residues, the red regions are the most favoured regions, the yellow regions are the appropriate regions, the light yellow regions are the barely permitted regions and the white regions are the disallowed regions圖1 綿羊Musclin蛋白的二級(jí)(A)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)及蛋白結(jié)構(gòu)的拉式構(gòu)象圖(C)Fig.1 Secondary structure(A), tertiary structure(B) and ramachandran plot(C) of Musclin protein in sheep

2.1.3 綿羊Musclin蛋白亞細(xì)胞定位及信號(hào)肽分析 應(yīng)用在線網(wǎng)站PredictProtein預(yù)測(cè)綿羊Musclin蛋白的亞細(xì)胞定位，綠色部分表示Musclin蛋白定位情況，結(jié)果顯示，綿羊Musclin蛋白主要定位于細(xì)胞外(圖2A)。經(jīng)SignalP分析，綿羊Musclin蛋白存在信號(hào)肽，1～27位氨基酸為信號(hào)肽位置，在28氨基酸位點(diǎn)處存在1個(gè)酶切位點(diǎn)(圖2B)。用TMHMM分析綿羊Musclin蛋白跨膜結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，綿羊Musclin蛋白不存在跨膜區(qū)(圖2C)。綜合以上結(jié)果，說(shuō)明綿羊Musclin為分泌性蛋白。

2.1.4 綿羊Musclin蛋白疏水性和磷酸化位點(diǎn)分析 使用ProtScale在線網(wǎng)站分析蛋白的疏水性(圖3A)，結(jié)果顯示，最大疏水指數(shù)為2.622，最大親水指數(shù)為-2.211，但從整體來(lái)看氨基酸序列有明顯的親水性區(qū)域，表明該蛋白有較強(qiáng)的親水性，因此預(yù)測(cè)此蛋白為可溶性蛋白。KinasePhos在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白的潛在磷酸化位點(diǎn)為3個(gè)絲氨酸激酶(82、88、128)，2個(gè)蘇氨酸激酶(47、77)，但并沒(méi)有酪氨酸激酶位點(diǎn)(圖3B)。

2.2 綿羊Musclin基因真核表達(dá)載體的酶切鑒定和測(cè)序鑒定

用BamH I -XhoI雙酶切pcDNA3.1-Musclin，得到近500(Musclin)和5 000 bp的兩條帶，說(shuō)明連接成功(圖4)。將測(cè)序結(jié)果與登錄號(hào)為XM_004003038.1的綿羊MusclinCDS序列在DNAMAN軟件中進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果正確，表明載體構(gòu)建成功，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 不同處理對(duì)綿羊肌細(xì)胞Musclin mRNA表達(dá)的影響

細(xì)胞分化48 h時(shí)，與空載體組相比，Musclin過(guò)表達(dá)組的MusclinmRNA表達(dá)量升高了4 056.77倍(P<0.01)；與空載體+胰島素組相比，Musclin過(guò)表達(dá)+胰島素組的MusclinmRNA表達(dá)量升高了3 202.59倍 (P<0.01,圖5)。

A. 亞細(xì)胞定位；B. 信號(hào)肽；C. 跨膜區(qū) A. Subcellular localization; B. Signal peptide; C. Transmembrane圖2 綿羊Musclin蛋白亞細(xì)胞定位及信號(hào)肽與跨膜區(qū)分析Fig.2 Subcellular localization, signal peptide and transmembrane analysis of the Musclin protein in sheep

A. 疏水性分析；B. 磷酸化分析 A. Hydrophobicity analysis; B. Phosphorylation analysis圖3 綿羊Musclin蛋白疏水性和磷酸化位點(diǎn)分析Fig.3 Hydrophobicity and phosphorylation site analysis of the Musclin protein in sheep

細(xì)胞分化72 h時(shí)，與空載體組相比，Musclin過(guò)表達(dá)組的MusclinmRNA表達(dá)量升高了6 024.56倍(P<0.01)； 與空載體+胰島素組相比，Musclin過(guò)表達(dá)+胰島素組的MusclinmRNA表達(dá)量升高了6 273.20倍 (P<0.01)；與Musclin過(guò)表達(dá)組相比，Musclin過(guò)表達(dá)+胰島素組的MusclinmRNA表達(dá)量升高了3.26倍(P<0.01,圖5)。

A. 酶切結(jié)果; B. DNAMAN比對(duì)結(jié)果，sheep1為質(zhì)粒測(cè)序，sheep2為gBlocks合成序列，sheep3為NCBI中序列 A.Results of digestion; B. Comparison results by DNAMAN, sheep1 is the sequence of plasmid， sheep2 is the gBlocks synthetic sequence， sheep3 is the sequence in NCBI圖4 pcDNA3.1-Musclin重組質(zhì)粒酶切鑒定和DNAMAN比對(duì)結(jié)果Fig.4 Results of digestion and DNAMAN comparison for the recombinant plasmid pcDNA3.1-Musclin

*. P<0.05，**. P<0.01，下同 *. P<0.05, **. P<0.01, the same as below圖5 不同轉(zhuǎn)染組綿羊Musclin mRNA表達(dá)的結(jié)果Fig.5 Expression result of sheep Musclin mRNA in different transfection groups

2.4 綿羊Musclin基因過(guò)表達(dá)及聯(lián)合胰島素對(duì)綿羊肌細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量的影響

細(xì)胞分化48 h時(shí)，與空載體組相比，Musclin過(guò)表達(dá)組的葡萄糖含量升高了0.14倍(P<0.05)；與空載體+胰島素組相比，Musclin過(guò)表達(dá)+胰島素組的葡萄糖含量升高了0.11倍(P<0.05)；與空載體組相比，空載體+胰島素組葡萄糖含量降低了0.08倍(P<0.05，圖6A)。

細(xì)胞分化72 h時(shí)，與空載體組相比，Musclin過(guò)表達(dá)組的葡萄糖含量升高了0.17倍(P<0.05)；與空載體+胰島素組相比，Musclin過(guò)表達(dá)+胰島素組的葡萄糖含量升高了0.19倍(P<0.05，圖6A)。

2.5 綿羊Musclin基因過(guò)表達(dá)及聯(lián)合胰島素對(duì)綿羊肌細(xì)胞中糖原含量的影響

細(xì)胞分化48 h時(shí)，與空載體+胰島素組相比，Musclin過(guò)表達(dá)組+胰島素組的糖原含量下降了0.15倍(P<0.05)；與空載體組相比，空載體+胰島素組糖原含量升高了0.31倍(P<0.01，圖6B)。

細(xì)胞分化72 h后，與空載體組相比，Musclin過(guò)表達(dá)組糖原含量降低了0.12倍(P<0.05)；與空載體+胰島素組相比，Musclin過(guò)表達(dá)+胰島素組的糖原含量下降了0.17倍(P<0.01)；與空載體組相比，空載體+胰島素組糖原含量升高了0.33倍(P<0.01)； 與Musclin過(guò)表達(dá)組相比，Musclin過(guò)表達(dá)組+胰島素組糖原含量升高了0.25倍(P<0.01，圖6B)。

A. 葡萄糖含量；B. 糖原含量 A. Content of glucose; B. Content of glycogen圖6 不同轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)液葡萄糖和細(xì)胞糖原含量Fig.6 Contents of glucose in media and glycogen in cells for different transfection groups

2.6 綿羊Musclin基因過(guò)表達(dá)及聯(lián)合胰島素對(duì)綿羊肌細(xì)胞糖代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

細(xì)胞分化48 h后，與空載體組相比，Musclin過(guò)表達(dá)組GLUT4 mRNA表達(dá)量降低了0.22倍(P<0.05)；與空載體+胰島素組相比，Musclin過(guò)表達(dá)+胰島素組GLUT4 mRNA表達(dá)量顯著降低了0.38倍(P<0.05)；與空載體組相比，空載體+胰島素組GLUT4和IRS1mRNA表達(dá)量分別升高了0.38和0.23倍(P<0.05，圖7)。

細(xì)胞分化72 h后，與空載體組相比，Musclin過(guò)表達(dá)組IRS1表達(dá)量降低了0.27倍(P<0.01)，AKT2和GLUT4 mRNA表達(dá)量降低了0.23和0.32倍(P<0.05)，AKT1 mRNA表達(dá)量降低了0.31倍(P<0.01)，GSK3β mRNA表達(dá)量升高了1.00倍(P<0.01)；與空載體+胰島素組相比，Musclin過(guò)表達(dá)+胰島素組的IRS1、AKT1、AKT2、GLUT1和GLUT4 mRNA表達(dá)量分別降低了0.46、0.39、0.55、0.64和0.31倍(P<0.01)；與空載體組相比，空載體+胰島素組IRS1、AKT1、AKT2和GLUT4 mRNA表達(dá)量分別升高了0.57、0.36、0.76和1.52倍(P<0.01)，GLUT1 mRNA升高了0.27倍(P<0.05)；與Musclin過(guò)表達(dá)組相比，Musclin過(guò)表達(dá)+胰島素組的GLUT1和GSK3β mRNA表達(dá)量分別下降0.48倍和0.62倍(P<0.01)，GLUT4 mRNA表達(dá)量升高了1.56倍(P<0.01，圖7)。

3 討 論

綿羊Musclin蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)均以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主。盡管綿羊Musclin的氨基酸序列與其他物種存在差異(結(jié)果未顯示)，但根據(jù)綿羊Musclin蛋白信號(hào)肽分析和亞細(xì)胞定位結(jié)果可以推測(cè)出綿羊Musclin蛋白與小鼠的類似，也屬于分泌蛋白，這與Nishizawa等[1]將Musclin定義為骨骼肌分泌因子的結(jié)果相符。

Nishizawa等[1]研究表明,高胰島素處理的小鼠肌肉中MusclinmRNA水平升高。本課題組前期研究結(jié)果表明,較高濃度胰島素能夠促進(jìn)綿羊Musclin啟動(dòng)子活性的增加[26]，說(shuō)明胰島素對(duì)Musclin的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可以起到上調(diào)作用。然而，本試驗(yàn)中細(xì)胞分化48或72 h時(shí)，胰島素+空載體組相比于空載體組的MusclinmRNA水平有增加趨勢(shì)但并沒(méi)有呈現(xiàn)顯著性差異。而細(xì)胞分化72 h時(shí)，Musclin過(guò)表達(dá)+胰島素組相比于Musclin過(guò)表達(dá)組的MusclinmRNA水平則顯著增加。這可能是由于存在某種能夠抑制胰島素對(duì)Musclin調(diào)控作用的機(jī)制。如，F(xiàn)oxO1是Musclin基因的上游轉(zhuǎn)錄因子，在小鼠成肌細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn),FoxO1-3A元件能調(diào)控Musclin基因的轉(zhuǎn)錄，抑制胰島素誘導(dǎo)的MusclinmRNA表達(dá)上調(diào)作用[27-28]。而當(dāng)細(xì)胞Musclin

圖7 不同轉(zhuǎn)染組相關(guān)基因mRNA表達(dá)結(jié)果Fig.7 Expression results of the related genes mRNA in different transfection groups

處于高水平時(shí)則會(huì)減弱這種抑制作用，從而表現(xiàn)出胰島素促進(jìn)Musclin表達(dá)的作用。胰島素通過(guò)上調(diào)Musclin表達(dá)而控制自身的作用，以相互協(xié)調(diào)而維持糖穩(wěn)態(tài)[29]。當(dāng)然，胰島素和Musclin之間精確的調(diào)控關(guān)系和機(jī)制與復(fù)雜的糖代謝有關(guān)，尚需要更多的系統(tǒng)研究。

本試驗(yàn)中，無(wú)論Musclin過(guò)表達(dá)組相比空載體組，還是Musclin過(guò)表達(dá)+胰島素組相比空載體+胰島素組，培養(yǎng)液中的葡萄糖含量明顯升高，細(xì)胞糖原含量則顯著降低。推測(cè)，綿羊Musclin可能通過(guò)抑制肌細(xì)胞攝取葡萄糖和糖原合成或者加快糖原分解而影響糖代謝并減弱胰島素功能。這與研究人員發(fā)現(xiàn)大鼠[2,14]和人[21]Musclin可通過(guò)紊亂葡萄糖代謝，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生相符。

IRS1受到胰島素刺激后可以酪氨酸化，激活下游PI3K-AKT信號(hào)通路[30-31]，從而促進(jìn)胰島素刺激的葡萄糖攝取和儲(chǔ)存。活化的AKT，一方面會(huì)促進(jìn)GLUT的表達(dá)或轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取[32-36]，另一方面使GSK3β N端的Ser殘基磷酸化而變成無(wú)活性形式，促進(jìn)糖原的合成[37-38]。為了進(jìn)一步研究綿羊Musclin影響糖代謝和胰島素功能的分子機(jī)制，本研究對(duì)糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)綿羊成肌細(xì)胞分化48 h時(shí)，Musclin過(guò)表達(dá)對(duì)IRS1、AKT1、AKT2、GLUT1、GSK3β mRNA的表達(dá)量沒(méi)有產(chǎn)生明顯影響，只有GLUT4 mRNA的表達(dá)變化顯著；而在分化72 h時(shí)，綿羊Musclin過(guò)表達(dá)則顯著抑制了正常或胰島素處理的成肌細(xì)胞中IRS1、AKT1、AKT2、GLUT1、GLUT4基因mRNA表達(dá)，上調(diào)了GSK3β mRNA的表達(dá)。說(shuō)明綿羊Musclin對(duì)糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用與成肌細(xì)胞的分化程度有關(guān)。誘導(dǎo)分化48 h時(shí)，分化程度不高，綿羊Musclin主要通過(guò)GLUT4基因的表達(dá)上調(diào)而發(fā)揮糖代謝調(diào)節(jié)作用，這與本課題組先前在未分化小鼠C2C12的研究結(jié)果一致[39]。而當(dāng)成肌細(xì)胞分化到一定程度時(shí)，綿羊Musclin可能通過(guò)下調(diào)糖代謝通路中IRS1、AKT1、AKT2、GLUT1、GLUT4基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，同時(shí)通過(guò)上調(diào)GSK3β基因的表達(dá)，抑制糖原合成，從而影響糖代謝并減弱細(xì)胞對(duì)胰島素的生物反應(yīng)。具體的調(diào)控模式尚需要利用各基因過(guò)表達(dá)或相應(yīng)蛋白增補(bǔ)、基因沉默或蛋白抑制劑增補(bǔ)等各種措施，在蛋白水平進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

綿羊Musclin過(guò)表達(dá)可以影響肌細(xì)胞糖代謝并減弱胰島素的作用。綿羊Musclin和胰島素通過(guò)相互協(xié)調(diào)以維持糖代謝穩(wěn)態(tài)，其作用機(jī)制涉及到IRS1、AKT1、AKT2、GLUT1、GLUT4和GSK3β相關(guān)基因表達(dá)的變化，并且與綿羊成肌細(xì)胞的分化狀態(tài)有關(guān)。本試驗(yàn)為進(jìn)一步揭示Musclin對(duì)綿羊肌肉發(fā)育的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。