京尼平對脂多糖誘導的KGN細胞株炎性反應的影響研究*

田東梅，廖海霞，王雪嬌,李亨利，尹 欣，朱明輝

(成都中醫藥大學醫學與生命科學學院/附屬生殖婦幼醫院，四川 成都 610000)

京尼平屬環烯醚萜類物質，由傳統中藥——杜仲等提取的京尼平苷經β-葡萄糖苷酶水解而成，是一種很好的炎癥抑制劑[1]。有研究發現，京尼平在抗腫瘤、抗血栓、抗炎和治療糖尿病等方面均具有顯著療效[2-3]。在生殖內分泌疾病中，多囊卵巢綜合征是一種常見疾病，常伴慢性炎癥和氧化應激[4-5]。有研究表明，多囊卵巢綜合征患者卵巢組織局部存在慢性炎性反應，主要是由于產生了過量的腫瘤壞死因子α、白細胞介素-6(IL-6)等，并激活核因子κB(NF-κB)，從而引發顆粒細胞過早凋亡，抑制了優勢卵泡的形成[6]。如何改善多囊卵巢綜合征患者的炎癥狀態，對其治療具有積極的意義。本研究利用脂多糖(LPS)模擬了人卵巢顆粒細胞系(KGN細胞株)的氧化應激狀態，探索了京尼平可能的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株來源 KGN細胞株由中國科學院成都生物研究所王飛教授惠贈。

1.1.2試劑與儀器 京尼平為北京索萊寶科技有限公司產品；CCK-8為日本同仁化學研究生產品，雌激素酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒購自貝斯維斯公司，線粒體解偶聯蛋白2(UCP2)、NF-κB抗體購自proteintech，17α羥化酶(CYP17A1)、芳香化酶(CYP19A1)抗體購自affinity，辣根過氧化物酶標記的二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司，杜氏改良Eagle培養基/F12培養基購自美國Gibco公司，電泳儀(型號Power Pac Basic)、酶標儀(型號iMarkTMMicroplate reader)均購自美國Bio-rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與分組 KGN細胞株培養采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μ/mL鏈霉素，置于37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養。待細胞密度達80%時加入2 μg/mL的LPS建立氧化應激狀態，繼續培養24 h后加入不同質量濃度的京尼平進行干預。設置空白對照組(添加相應劑量溶劑二甲基亞砜的DMEM/F12培養基)、LPS組和LPS+0.05、0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平組。

1.2.2KGN細胞株活性檢測 不同質量濃度(0、0.05、0.10、0.20、0.30 mmol/L)京尼平處理KGN細胞株，干預0、12、24、36、48 h后每孔加入CCK-8溶液10 mL再孵育1 h；在酶標儀450 nm波長下檢測光密度值(OD值)。實驗獨立重復3次，每次設立5個復孔。

1.2.3細胞培養液中雌激素、IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6檢測 采用ELISA檢測不同質量濃度京尼平干預24 h后細胞培養液中雌激素、IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6水平。設置空白孔、空白對照孔、標準品孔及樣品孔。空白孔、空白對照孔不加樣品，只加顯色劑A、B和終止液用于調零；標準品孔加入配好的標準品50 μL，后加入辣根過氧化物酶100 μL；樣品孔加入樣本50 μL后加入辣根過氧化物酶100 μL，37 ℃溫育60 min。每孔加滿洗滌液，靜置1 min后棄上清液，重復洗滌5次，拍干后每孔先加入底物液A 50 μL，再加入底物液B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL終止反應。以空白孔調零，依序測量各孔450 nm波長OD值，計算樣品質量濃度。

1.2.4蛋白質印跡(Western blotting)法檢測KGN細胞株UCP2、NF-κB、CYP19A1、CYP17A1蛋白表達 采用RIPA 蛋白裂解液提取各組KGN細胞株總蛋白，采用BCA法測定細胞總蛋白濃度。上樣量根據測得的蛋白濃度計算，確保每孔上樣量相同，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺120 V電泳，低溫轉膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加對應的一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗常溫孵育1 h，充分洗滌后采用超敏化學發光底物試劑盒進行顯影，反應5 min后開始膠片曝光。蛋白表達量用目標蛋白與內參β-actin的OD值比值表示。

2 結 果

2.1不同質量濃度京尼平對KGN細胞株活性的影響 與空白對照組比較，LPS+0.5 mmol/L京尼平組KGN細胞株活性無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)；LPS+0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平組KGN細胞株生長受到明顯抑制，差異均有統計學意義(P<0.05)；隨時間增加，LPS+0.20、0.30 mmol/L京尼平組KGN細胞株生長明顯受到抑制，細胞數量越來越少。見圖1。

與LPS+0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平組比較，aP<0.05。

2.2不同質量濃度京尼平對氧化應激狀態下雌激素水平，以及IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6表達的影響 各組KGN細胞株雌激素水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。與LPS組比較，空白對照組KGN細胞株IL-4、IL-5、IL-6、IL-1β表達均明顯降低，LPS+0.05、0.20、0.30 mmol/L京尼平組KGN細胞株IL-4表達均明顯降低，LPS+0.05、0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平組KGN細胞株IL-5表達均明顯降低，LPS+0.30 mmol/L京尼平組KGN細胞株IL-1β表達明顯降低，LPS+0.20、0.30 mmol/L京尼平組IL-6表達均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；其余各組IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6表達比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.3各組KGN細胞株CYP17A1、CYP19A1、UCP2、NF-κB蛋白表達比較 與LPS組比較，空白對照組KGN細胞株UCP2、NF-κB蛋白表達均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；LPS+0.05、0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平組KGN細胞株UCP2蛋白表達均略有下降，但差異均無統計學意義(P>0.05)；LPS+0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平組KGN細胞株NF-κB蛋白表達均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；LPS+0.05 mmol/L京尼平組細胞株NF-κB蛋白表達無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)。LPS+0.10、0.20、0.30 mmol/L京尼平組間KGN細胞株NF-κB蛋白表達比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。各組KGN細胞株CYP17A1、CYP19A1蛋白表達比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

氧化應激作為機體氧化還原反應失衡的直接表現，活性氧濃度升高，超出內源性抗氧化系統的清除能力，最終導致細胞氧化損傷。氧化應激參與精卵和胚胎的重要生理活動，當其濃度失控時會損害精子、卵子和胚胎質量，使受孕失敗[7]。因此，最大限度地避免產生過量活性氧至關重要。臨床對改善女性生殖系統氧化應激的藥物較少，作用機制尚不明確。有研究發現，京尼平在抗炎和治療糖尿病等方面療效顯著[2-3]。而京尼平在生殖系統方面的研究較少。本研究從分子水平了解了在LPS誘導KGN細胞株氧化應激狀態下京尼平的抗炎作用。

3.1京尼平對常規條件下培養的KGN細胞株活力的影響 本研究結果顯示，京尼平質量濃度為0.05 mmol/L時對細胞活性無明顯影響，京尼平質量濃度大于或等于0.10 mmol/L時KGN細胞株出現明顯抑制，且隨質量濃度增加抑制作用更明顯，京尼平質量濃度大于或等于0.20 mmol/L時KGN細胞數量出現肉眼可見的減少，說明京尼平質量濃度過高時對細胞具有致死性。目前，已有研究發現，京尼平質量濃度過高會促進細胞凋亡，而適當質量濃度京尼平可緩解細胞的氧化應激而提高其存活率[8-11]。

3.2京尼平對氧化應激狀態下KGN細胞株分泌功能的影響 有研究發現，京尼平質量濃度為50 mmol/L時能顯著提高3β-羥基類固醇脫氫酶、CYP17A1、17β羥化類固醇脫氫酶表達水平，從而促進睪酮和雌二醇合成[12]。本研究結果顯示，各組KGN細胞株CYP17A1、CYP19A1蛋白表達比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；各組上清液中雌激素水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，提示炎性狀態未影響細胞雌激素分泌，但尚需進一步研究證實。

3.3京尼平對氧化應激狀態下KGN細胞株的抗炎作用 UCP2在線粒體電子傳遞鏈的能量代謝中發揮著重要作用，與抗氧化應激系統密切相關[13]。有研究發現，UCP2在人卵丘細胞中表達，可能參與卵泡發育和卵母細胞成熟和質量調控[14]。本研究結果顯示，添加LPS后UCP2、NF-κB蛋白，以及IL-4、IL-5、IL-6、IL-1β表達均明顯增加。炎癥指標的明顯增加提示氧化應激模型的成功建立。不同質量濃度京尼平干預后IL-4、IL-5表達均明顯降低，高質量濃度京尼平干預后IL-6、IL-1β表達均明顯降低，NF-κB蛋白表達也下降，提示京尼平具有抗炎作用，但不同質量濃度京尼平干預后UCP2蛋白表達比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。可能由于京尼平不通過調節UCP2蛋白的表達而發揮抗炎作用。已有的研究表明，京尼平能有效抑制LPS引起的KGN細胞株誘導型一氧化氮合酶等炎癥因子的表達[15]，與本研究結果一致，提示京尼平具有抗炎作用。另有研究發現，京尼平可通過阻斷NF-κB減輕LPS誘導的炎性反應，從而緩解急性肺損傷[16]。本研究在KGN細胞株中同樣發現京尼平可通過阻斷NF-κB蛋白表達而減輕LPS誘導的炎性反應。

綜上所述，京尼平可緩解LPS誘導的KGN細胞株氧化應激狀態，可能通過調節NF-κB蛋白表達而發揮抗炎作用，降低IL-4、IL-5、IL-6、IL-1β水平。京尼平在氧化應激狀態下對雌激素分泌無明顯影響，但尚需進一步研究證實。