脂聯素在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義

彭小飛，張 涵，廖家李，麥孜悅，曾 健

（廣西醫科大學第一附屬醫院胃腸腺體外科，廣西 南寧 530021）

乳腺癌（breast cancer）是全球女性癌癥相關死亡的主要原因，血管生成在乳腺癌的發展過程中起著至關重要的作用[1]。多項研究表明[2，3]，血管生成因子（如血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子、轉化生長因子-β 等）水平以及其形成的微血管密度是乳腺癌存活率的重要預測因素。研究表明，脂聯素與血管生成有關的差異表達基因密切相關，其由244 個氨基酸組成的3 kDa 蛋白，由脂肪細胞產生和分泌，是脂肪組織中分泌最多的蛋白類激素[4]，其受體在正常和惡性乳腺組織中均有表達[5]，具有抗炎和抗動脈粥樣硬化的特性，可以抑制細胞增殖，降低胰島素抵抗，促進細胞凋亡[6-8]。本研究主要探討脂聯素在乳腺癌組織中的表達及與臨床病理特征的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 乳腺癌血管生成相關因子的篩選 基于癌癥基因組圖譜（TCGA）中的乳腺癌數據，結合AmiGO2 衍生的血管生成基因集，篩選出與乳腺癌血管生成有關的因子脂聯素。利用GEPIA2 數據庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）對癌癥基因組圖譜數據庫進行分析，確定脂聯素在正常組織及癌組織表達差異，并對其進行生存曲線分析。

1.2 一般資料 收集2019 年11 月～2020 年8 月廣西醫科大學第一附屬醫院手術切除且病理檢查確診為乳腺癌的癌組織及癌旁組織80 例，所有病例術前均未行放、化療等治療。收集患者的臨床資料數據，包括年齡、月經史、腫瘤直徑、淋巴結轉移、組織學分級、ER、PR、HER2、Ki-67、臨床分期。本研究經廣西醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色 制作石蠟包埋的組織標本，切片（厚4～5 μm），免疫組織化學采用S-P 法，一抗為兔抗人VEGF 單克隆抗體（福建邁新生物工程公司），工作濃度1∶20，S-P 免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。光學顯微鏡下觀察，胞質或胞膜中呈現棕黃色顆粒為陽性染色信號，每例切片隨機觀察10 個高倍視野。按腫瘤細胞著色強度和陽性細胞率分別評分，其中細胞著色強度：無著色為0 分、淺黃色為1 分、棕黃色為2 分、棕褐色為3 分；陽性細胞率：無陽性細胞為0 分、陽性細胞數＜10%為1 分、11%～50%為2 分、51%～75%為3 分、＞75%為4 分。上述兩者積分相乘為最后結果：0～2 分為－、3～5 分為+、6～8 分為++、9～12 分為+++。

1.3.2 qRT-PCR 法檢測 提取癌和癌旁組織中的總RNA，逆轉錄成cDNA。PCR 反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共循環40 次。用2-△△CT法計算目的基因相對表達量。

1.4 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件進行數據處理，計量資料以（）表示，兩組均數間比較采用t檢驗，組間比較采用方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 數據庫信息結果分析 利用GEPIA2 軟件（http：//gepia.cancer-pku.cn/）對腫瘤基因組圖譜項目數據庫中乳腺癌組織標本和乳腺正常組織的mRNA 表達數據進行分析,結果顯示脂聯素在乳腺正常組織中高表達（logFC＞1，P＜0.05），脂聯素表達高低對乳腺癌預后有影響，見圖1。

2.2 脂聯素在乳腺癌組織和正常組織中的表達 乳腺癌組織中脂聯素陽性表達率為65.00%（52/80），低于癌旁組織中的陽性率91.25%（73/80），差異有統計學意義（χ2=7.864，P＜0.05）。

2.3 脂聯素mRNA 在乳腺癌組織和正常組織中的表達水平 乳腺癌組織中脂聯素mRNA 相對表達量為（0.683±0.317），高于癌旁組織中的（0.493±0.294），差異有統計學意義（t=3.105，P＜0.05）。

2.4 脂聯素表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系不同年齡、月經史、ER、PR、HER2、Ki-67 表達間脂聯素表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同腫瘤直徑、淋巴結轉移、組織學分級、臨床分期間脂聯素表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

圖1 脂聯素在乳腺癌組織和正常組織中的表達

表1 脂聯素表達與乳腺癌臨床病理特征的關系（n）

3 討論

血管生成因子可以促使內皮細胞向腫瘤細胞遷移，經過增殖，最終管道化并分支形成血管環，進而促進腫瘤細胞的血管生成，導致乳腺癌的侵襲和轉移。血管生成因子水平與乳腺癌的分期、分級和臨床預后密切相關，在乳腺癌的發生和發展中具有重要的作用[9,10]。除此之外，血管內皮生長因子（VEGF）作為最重要的血管生成因子，其過度表達與人類的多種腫瘤（乳腺癌、胃癌、結腸癌等）的發生密切相關[11,12]。有報道稱[13]，脂聯素可能通過促進乳腺癌細胞自噬小體的活性和降低隔離體1/GAP 相關的酪氨酸磷酸化蛋白p62 信號通路來抑制癌細胞的生長。此外，脂聯素通過調節LKB1-AMPK-SK6 軸抑制乳腺癌細胞的轉移，并刺激AMPK 磷酸化，導致mTOR 活性降低，表現為SK6 磷酸化降低，進而導致腫瘤抑制因子LKB1 表達增加[14]。因此，脂聯素具有延緩腫瘤生長、血管生成和VEGF 的表達特性，通過直接調節與腫瘤生長相關的信號通路來降低惡性腫瘤的發展已成為脂聯素新的研究熱點[15]。

研究表明[16]，被診斷為乳腺癌的肥胖患者的預后往往更差，而且無論絕經狀態如何，癌癥進展和復發的風險都會增加。另外，已證實肥胖和2 型糖尿病患者與其循環中脂聯素的水平呈負相關[17]。因此，研制重組脂聯素或脂聯素受體激動劑，提高血清脂聯素水平及脂聯素受體水平可能為乳腺癌的治療提供新的思路。本研究基于癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫和AmiGO2 衍生的血管生成基因集，篩選出與乳腺癌血管生成有關的因子脂聯素，通過免疫組織化學染色和RT-PCR 測定發現，脂聯素在乳腺癌和正常組織中存在表達差異，脂聯素在乳腺正常組織中的表達含量高于乳腺癌組織（P＜0.05）。結合患者臨床病理特征分析，結果發現不同年齡、月經史、ER、PR、HER2、Ki-67 表達間脂聯素表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同腫瘤直徑、淋巴結轉移、組織學分級、臨床分期間脂聯素表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05），進一步說明脂聯素具有抑制乳腺癌發生和發展的作用。

綜上所述，脂聯素在乳腺組織中呈高表達，乳腺癌組織中呈低表達，其可作為乳腺癌新的生物標記物，預測乳腺癌的發生、發展及預后，并為乳腺癌的治療提供參考。