預針刺結合穴位注射對胃潰瘍大鼠胃黏膜的損傷修復作用及機制探討

程佑民 林靜瑜 周 凡 黃培煒 陳 祺 許金森

1.福建省中醫藥科學院，福建福州 350003；2.福建中醫藥大學針灸學院，福建福州 350108

非甾體抗炎藥（Non-steroidal Antiinflammatory Drugs，NSAIDs）相關性胃病是臨床的常見病、多發病，嚴重者可出現大面積潰瘍、出血，甚至危及生命等。目前臨床上NSAIDs 相關胃病治療藥物中，常規劑量的H2受體阻斷劑防治胃潰瘍效果不佳，米索前列醇的不良反應發生率高、耐受性差[1-2]，質子泵抑制劑（PPI）長期應用可加重NSAIDs 相關性腸損傷、誘發胃癌等風險[3-4]。經絡理論指導下的針灸療法以其安全綠色、療效特異走向世界[5]。針刺（灸）足三里穴預防與治療胃黏膜損傷性疾病已有許多報道[6-8]，但將足三里“未病先防”與“既病防變”之功效聯合并用的報道不多見，本研究采用足三里穴“未病之時”預針刺結合“疾病后”注射生理鹽水的治療方式，探討針刺防治胃膜損傷的作用，初步分析其機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF 級雄性SD 大鼠，體重：200～220 g，由浙江省醫學科學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（淅）2019-0002；大鼠適應性飼養5 d，隨機分為空白對照組、模型對照組、西咪替丁治療組、足三里治療組，每組各8 只。

1.2 主要試劑

吲哚美辛對照品（S18048-5 g，純度99%，源葉生物科技有限公司）；西咪替丁注射液（國藥準字H35021176，規 格2 ml ∶0.2 g×10 支，批號：2005241，福州福藥海王制藥有限公司）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（A005-1-2，南京建成生物工程研究所）；超氧化物岐化酶（SOD）試劑盒（A001-3-2，南京建成生物工程研究所）；微量丙二醛（MDA）測試盒（A003-2-1，南京建成生物工程研究所）；4%多聚甲醛（XS191108，Servicebio）；HE 染色試劑 盒（G1120，Solarbio），中性樹膠（G8590，Solarbio）；血紅素氧合酶1/熱休克蛋白32（HO-1）抗體（bs-2075R，Bioss）；核因子2 相關因子2（Nrf2）抗體（bs-1074R，Bioss）。

1.3 主要儀器

酶標儀（Varioskan Flash，Therom）；石蠟切片機（RM2235，Lecia）；組織包埋機（YB-7LF，孝感亞光）；組織脫水機（ZT-14V2，孝感亞光）；脫色搖床（TS-92，其林貝爾）；恒溫箱（DYY-6C，北京六一）；微波爐（MM721AAU-PW，美的）；顯微鏡（MDL，Lecia）；數顯恒溫電子水浴鍋（HH-6，常州國華）；離心機（ST16R，Therom）。

1.4 分組與預針刺

大鼠適應性飼養5 d 后按隨機數字表法分為四組：空白對照組、模型對照組、西咪替丁治療組、足三里治療組，每組各8 只。分組后，足三里治療組立即進行預電針干預，具體方法：大鼠每日固定于黑色彈性鼠套，待安靜時，拉伸出左下肢，電針雙側足三里穴（電針參數：疏密波、刺激頻率為2 Hz/10 Hz），20 min/（次·d），連續6 d；模型對照組、西咪替丁治療組大鼠每日同時同等固定于鼠套20 min/（次·d），連續6 d，空白對照組不予任何處理。

1.5 造模與干預

預針刺結束后各組大鼠禁食不禁水18 h，第7 天模型對照組、西咪替丁治療組、足三里治療組大鼠腹腔注射35 mg/kg 吲哚美辛混懸液制備胃潰瘍模型。吲哚美辛注射60 min 后，對西咪替丁治療組、足三里治療組大鼠進行干預，具體干預方法：西咪替丁治療組于肌肉點注射西咪替丁50 mg/kg，足三里治療組于雙側足三里穴注射生理鹽水0.5 ml/kg。注射部位定位[9-10]：足三里定位于后肢膝關節外下方當腓骨小頭下約5 mm處，肌肉點定位于膝關節內側，與足三里平行肌肉豐厚的非經非穴點，避免其他經脈、穴位作用的影響。

1.6 取材與指標檢測

1.6.1 血清SOD、MDA、GSH-Px 檢測 吲哚美辛注射后7 h，各組大鼠腹腔注射1 0% 水合氯醛3 ml/kg、腹主動脈采血、離心、取血清，按南京建成試劑盒方法檢測SOD、MDA、GSH-Px。

1.6.2 胃黏膜大體觀察與胃潰瘍指數計算 大鼠采血完畢，暴露胃部，結扎幽門，從賁門處注射3 ml 4% 多聚甲醛，結扎賁門，剪取整胃，置4%多聚甲醛中固定30 min，取出胃，剪開，輕洗去多聚甲醛，用電子游標卡尺測量胃黏膜出血點及潰瘍點，采用Guth 法[11]計算胃潰瘍指數（UI）。

1.6.3 胃組織病理形態學 觀察剪取典型部位胃組織塊1.0 cm×1.0 cm，置于4% 多聚甲醛固定24 h，常規脫水、石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色、光鏡下觀察胃組織病理形態學變化。

1.6.4 胃組織Nrf2、HO-1 免疫組化檢測 另取空白切片脫蠟至水，抗原修復、PBS 洗滌、山羊血清封閉、一抗孵育、HRP 標記二抗孵育、DAB 染色、蘇木精復染，0.1% 鹽酸酒精分化，中性樹膠封片，光鏡100 倍下觀察Nrf2、HO-1 大致表達，400 倍視野下隨機選取4 張圖片，采用IPP 6.0分析每張圖片陽性表達的積分光密度（IOD），計算IOD/Area，取平均值。

1.7 統計學分析

采用SPSS 23.0 統計學軟件對數據進行分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗，資料符合正態分布，組間差異采用單因素方差分析，方差齊性時，多組間兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時，多組間兩兩比較采用Dunnett T3法；資料不符合正態分布，組間差異采用K 個獨立樣本的非參數檢驗，組間兩兩比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠胃潰瘍指數比較

與模型對照組比較，西咪替丁治療組、足三里治療組的胃潰瘍指數明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠胃潰瘍指數比較（，n=8）

表1 各組大鼠胃潰瘍指數比較（，n=8）

注：與模型對照組比較，**P ＜0.01；潰瘍抑制率（%）=（模型對照組平均UI-治療組平均UI）/模型對照組平均UI×100%；“-”表示無數據

2.2 各組大鼠胃黏膜組織形態學比較

肉眼可見，模型對照組大鼠胃黏膜外觀損傷嚴重，胃黏膜變薄，皺襞減少，有明顯的出血及潰瘍點；西咪替丁治療組、足三里治療組胃黏膜外觀損傷狀況明顯輕于模型對照組；光鏡下，空白對照組大鼠胃黏膜層完整，上皮細胞和腺體排列整齊均勻，大小基本一致，胃小凹結構清晰，未見充血、腫脹；模型對照組大鼠黏膜上皮細胞變性、脫落、腺體排列紊亂、腺體與胃小凹之間分界模糊不清，部分黏膜層可見紅細胞、水腫。西咪替丁治療組、足三里治療組胃黏膜上皮細胞脫落、變性較輕，胃小凹結構尚清晰，腺體排列局部紊亂，少見紅細胞。見圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜病理形態比較（HE×200）

2.3 各組血清SOD、GSH-Px活力、MDA含量比較

與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清SOD、GSH-Px 活力明顯下降（P＜0.01），MDA 含量明顯上升（P＜0.05）；與模型對照組比較，西咪替丁治療組、足三里治療組GSH-Px 活力升高（P＜0.05、P＜0.01）、MDA 含量下降（P＜0.01、P＜0.05），SOD活力呈一定升高的趨勢，但差異無統計學意義。見表2。

表2 各組大鼠血清SOD、GSH-Px活力、MDA含量比較（，n=8）

表2 各組大鼠血清SOD、GSH-Px活力、MDA含量比較（，n=8）

注：與空白對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

2.4 各組大鼠胃組織Nrf2、HO-1蛋白表達情況

Nrf2、HO-1 在大鼠胃黏膜組織胞漿、胞核均有表達，呈棕黃色或棕褐顆粒。與空白對照組比較，西咪替丁治療組Nrf2 陽性表達減少（P＜0.05），足三里治療組Nrf2 陽性表達增強（P＜0.05）；與模型對照組比較，西咪替丁治療組Nrf2 陽性表達明顯減少（P＜0.01），足三里治療組Nrf2 陽性表達呈增強的趨勢，但差異無統計學意義；與空白對照組比較，模型對照組、西咪替丁治療組HO-1 表達明顯減少（P＜0.05、P＜0.01）；與模型對照組比較，足三里治療組HO-1 表達明顯增強（P＜0.05）；與西咪替丁治療組比較，足三里治療組Nrf2、HO-1 陽性表達均增強（P＜0.01）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠Nrf2、HO-1 表達比較（×400）

表3 各組大鼠胃組織Nrf2、HO-1表達比較（IOD/Area，，n=8）

表3 各組大鼠胃組織Nrf2、HO-1表達比較（IOD/Area，，n=8）

注：與空白對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與西咪替丁治療組比較，◇◇P ＜0.01

3 討論

針灸療效受諸多因素影響，除經脈、腧穴的主治功能外，個體的狀態、疾病的進程[12-13]、針刺的刺激量、療程[14-15]、調神得氣[16-17]等對針灸效應的發揮亦十分重要。《靈樞·九針十二原》中提到“刺之要，氣至而有效”[18]，說明“氣至”是針刺起效的關鍵。《難經·七十八難》云“當刺之時，必先以左手厭按所針榮俞之處，彈而努之，爪而下之，其氣之來，如動脈之狀”[19]，詳述了對“氣至”的激發?！峨y經·八十難》又道“謂左手見氣來至，乃內針”[19]，提出了“氣至”應在針刺治療前。良性的預針（灸）對多種疾病具有一定的療效，現代研究表明，預針灸可能通過啟動機體內源性保護體系，糾正疾病狀態下生化、分子標記物的改變[20-22]。

足三里為足陽明胃經下合穴，“合治內府”，為治療胃腑疾病首選穴位之一。筆者前期工作發現，單次針刺足三里（或穴位注射）對無水乙醇、非甾體抗炎藥實驗性急性胃潰瘍療效不夠顯著。在此基礎上，本研究基于中醫“治未病”的思想，采用防治結合的方案，通過預針刺足三里疏通經絡、激發胃經經氣，并在胃潰瘍造模后足三里注射生理鹽水，取得了較好的療效，其胃黏膜保護作用與50 mg/kg 西咪替丁肌肉注射相當。

非甾體抗炎藥胃黏膜損傷機制涉及多個方面，包括直接損傷胃黏膜屏障、抑制胃黏膜環氧化酶（COX）的活性、降低胃黏膜血流量、氧自由基損傷等[23]。其中，氧自由基參與了NSAIDs 胃病局部直接損傷和吸收后損傷的多個環節，SOD、GSH-Px 是機體重要的酶類自由基清除因子，MDA 可間接反映組織過氧化損傷程度。本研究結果顯示，胃潰瘍模型大鼠存在著明顯的氧化還原失衡狀態，SOD、GSH-Px 活力下降，MDA 含量升高；針刺足三里可一定程度地糾正這一狀態。

Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白1-核轉錄相關因子2-抗氧化反應元件（Keap1-Nrf2-ARE）通路被認為是細胞抗氧化機制中最重要的通路，Nrf2 通過核轉位，介導了HO-1、SOD、GST 等多種抗氧化物酶、藥物代謝酶和藥物轉運體的表達和轉錄[24]，促進機體的抗氧化應激。誘導型HO-1 對氧化應激反應敏感，催化血紅素、阻止游離血紅素參與氧化反應。本研究中足三里治療組胃組織Nrf2、HO-1 蛋白陽性表達升高，提示針刺足三里可能激活了Nrf2/HO-1 通路增強機體的抗氧化應激能力，促進胃黏膜修復。

綜上所述，足三里預針刺結合穴位注射對吲哚美辛實驗性胃潰瘍具有保護與修復作用，其機制可能與抗氧化有關。