益氣養陰消癭方對自身免疫性甲狀腺炎模型大鼠B 細胞活化的調節作用

李 揚 牧亞峰 左新河, 田 曼▲ 趙 勇

1.湖北省中醫院甲狀腺疾病診療中心，湖北武漢 430070；2.湖北省中醫藥研究院甲狀腺疾病診療中心，湖北武漢 430070；3.湖北中醫藥大學第一臨床學院，湖北武漢 430061

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）是一種甲狀腺的自身免疫性疾病，臨床中以橋本甲狀腺炎（hashimoto thyroiditis，HT）最為常見，近年來HT的發病率高達3%～4%，并呈逐年增高趨勢[1-2]。AIT 的典型病理改變為甲狀腺淋巴細胞浸潤，進一步出現纖維化、腫大或結節樣改變，甚至引起甲狀腺功能減退，并對妊娠結局有不良影響，研究其防治對優生優育有重要意義。本病目前尚無根治方法，西醫主要以對癥治療為主，或聯合硒劑或糖皮質激素等藥物，而激素類藥物易并發胃腸道反應、糖代謝異常及電解質紊亂等諸多不良反應，因此尋求安全有效的治療策略十分必要。中醫藥在治療AIT 方面有獨特的優勢，益氣養陰消癭方是已故全國名中醫陳如泉教授根據多年臨床經驗所擬，具益氣養陰、消癭散結之功，臨床療效良好，且不良反應少，前期研究發現該方能改善AIT 模型大鼠甲狀腺功能、減輕甲狀腺腫大[3]。本研究擬進一步探討其對AIT 的免疫調節機制，為該方臨床應用提供更深層次理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4～5 周SPF 級雌性SD 大鼠50 只，體重100～120 g，購自湖北省實驗動物研究中心（動物許可證號SCXK 鄂2017—0012，合格證號：42010200002809），由湖北中醫藥大學倫理委員會審核批準動物實驗。飼養于湖北中醫藥大學動物中心SPF 動物實驗室，室溫20～24℃，濕度40%～60%，適應性喂養1 周。

1.2 主要藥物與試劑

豬甲狀腺球蛋白（pTg）、碘化鈉（NaI）、完全弗氏佐劑（CFA）、不完全弗氏佐劑（IFA），購自Sigma 公司（貨號分別為T1126、746371、F5881、F5506）。B 細胞活化因子（BAFF）檢測試劑盒（武漢優爾生科技股份有限公司，批號：SEB686Ra）。白細胞介素-10（IL-10）一抗（IL-10 Rabbit pAb，abclonal 公司，批號：A2171），Dako REAL EnVision Detection System（安捷倫Dako，K5007）。促甲狀腺激素（TSH）、甲狀腺球蛋白抗體（TGAb）、甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司；批號分別為E-EL-R0976、SBJ-R0551、CSBE11199r）。益氣養陰消癭方為陳如泉教授所擬，由黃芪30 g、白芍30 g、鬼箭羽20 g、穿山龍20 g 四味中藥配制成1 g/mL 的溶液。

1.3 動物分組及造模方法

實驗動物按隨機數字表法分為正常對照組、模型組、益氣養陰消癭方低、中、高劑量組，每組10 只。除正常對照組外，其余組大鼠按本課題組前期成熟方法進行造模[4-6]。初次免疫：pTg 與CFA 等體積混合乳化，多部位皮下免疫注射（pTg 100 μg/只），每周1 次，共2 次，同時給予高碘水（1 L 水中加入0.64g NaI）直到實驗結束。再次免疫：pTg 與IFA 等體積混合乳化，再次進行多部位皮下免疫注射（pTg 100 μg/只），每周1 次，共4 次。

1.4 給藥方法

造模后開始藥物干預，正常對照組與模型組每天予以生理鹽水5 mL/kg 灌胃，益氣養陰消癭方低、中、高劑量組分別以益氣養陰消癭方溶液6、12、24 g/kg灌胃，連續6 周。

1.5 檢測方法：

1.5.1 ELISA 法檢測血清TSH、TGAb、TPOAb 及BAFF含量 心臟采血，室溫靜置2 h，以轉速2000 r/min 離心10 min，離心半徑6 cm，取血清至EP 管中，-20℃儲存。血清TSH、TGAb、TPOAb 及BAFF 檢測均按試劑盒說明書詳細步驟規范操作，讀數。

1.5.2 免疫組化法檢測甲狀腺組織IL-10 的相對表達水平 實驗結束后，各組大鼠禁食禁水12 h，稱重，10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，分離甲狀腺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE 染色觀察甲狀腺組織病理改變，免疫組化法檢測甲狀腺組織IL-10 表達。主要步驟為：脫蠟，3%過氧化氫液封閉，血清封閉，再分別加入IL-10 的一抗（1∶100），孵育，PBS 沖洗，再按Dako REAL EnVision Detection System試劑盒標準步驟操作，最后經DAB 溶液顯色。陰性對照以PBS 代替一抗。以棕黃色顆粒為陽性。每張玻片隨機選擇20 個視野（400×），用HMIAS-2000 千屏高清彩色醫學圖文分析系統進行吸光度測量并自動轉換為吸光度（A）值，每個標本的IL-10 相對表達含量用20 個視野的平均A 值表示。

1.6 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件對所得數據進行分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清TSH 及TGAb、TPOAb 含量的比較

與正常對照組比較，模型組血清TSH、TGAb、TPOAb 濃度均升高，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。益氣養陰消癭方中、高劑量組TSH、TPOAb、TGAb 濃度均低于模型組，差異均有高度統計學意義（均P ＜0.01），益氣養陰消癭方低劑量組TPOAb、TGAb 濃度低于模型組，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）。益氣養陰消癭方中、高劑量組TSH 濃度均低于益氣養陰消癭方低劑量組，差異均有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；而益氣養陰消癭方中、高劑量組TSH 濃度比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。益氣養陰消癭方低、中、高劑量組TPOAb 濃度兩兩比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。益氣養陰消癭方高劑量組TGAb 濃度低于益氣養陰消癭方中、低劑量組，且益氣養陰消癭方中劑量組低于益氣養陰消癭方低劑量組，差異均有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清TSH 及TGAb、TPOAb 含量的比較（）

表1 各組大鼠血清TSH 及TGAb、TPOAb 含量的比較（）

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與益氣養陰消癭方低劑量組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與益氣養陰消癭方中劑量組比較，▲P ＜0.05。TSH：促甲狀腺激素；TPOAb：甲狀腺過氧化物酶抗體；TGAb：甲狀腺球蛋白抗體

2.2 各組大鼠甲狀腺組織病理觀察結果

與正常對照組比較，模型組甲狀腺組織可見大量淋巴細胞浸潤，甲狀腺濾泡結構紊亂。與模型組比較，益氣養陰消癭方各劑量組甲狀腺淋巴細胞浸潤減少，甲狀腺濾泡結構紊亂減輕。見圖1。

2.3 各組大鼠血清BAFF 含量比較

與正常對照組比較，模型組血清BAFF 含量升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）。與模型組比較，益氣養陰消癭方各劑量組BAFF 含量均降低，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。益氣養陰消癭方高劑量組BAFF 含量低于益氣養陰消癭方低劑、中劑量組，差異均有統計學意義（均P ＜0.05），益氣養陰消癭方低、中劑量組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖2。

2.4 各組大鼠甲狀腺組織IL-10 的表達水平比較

在大鼠甲狀腺組織中，IL-10 主要表達于濾泡上皮細胞。與正常對照組比較，模型組甲狀腺組織IL-10相對表達水平顯著降低，差異有統計學意義（P ＜0.05）。與模型組比較，益氣養陰消癭方各劑量組甲狀腺組織IL-10 相對表達水平均升高，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。益氣養陰消癭方中、高劑量組IL-10表達水平均高于益氣養陰消癭方低劑量組，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。益氣養陰消癭方中、高劑量組IL-10 相對表達水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖3～4。

圖1 各組大鼠甲狀腺組織病理學觀察（HE 染色，100×）

圖2 各組大鼠血清BAFF 水平比較（n=10）

圖3 各組大鼠甲狀腺組織IL-10 免疫組化（400×）

3 討論

HT 是AIT 中最為常見的類型，TGAb、TPOAb 是參與HT 病理損傷的核心抗體，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用是HT 的主要病理機制[7]。目前西藥治療HT 方法十分有限，臨床用藥局限于硒制劑糖皮質激素。本研究采用以皮下注射pTg 并配合高碘水喂養的經典方法模擬HT 模型，觀察了益氣養陰消癭方對AIT 模型大鼠TGAb、TPOAb 的影響，結果發現益氣養陰消癭方可顯著降低血清TGAb、TPOAb 含量，下調TSH 水平，體現出對甲狀腺功能的保護作用，從而顯示了中藥調節甲狀腺免疫失衡的優勢。

圖4 各組大鼠甲狀腺組織IL-10 免疫組化吸光度半定量分析（n=10）

多數研究證實T 細胞免疫失調是AIT 的核心機制[8-10]，而B 細胞的激活及其對T 細胞應答的效應是AIT 不可或缺的重要環節[11-12]。TGAb、TPOAb 均由B淋巴細胞產生，B 細胞激活CD8+T 細胞和巨噬細胞[13]，損傷甲狀腺濾泡上皮細胞[14]。BAFF 是B 細胞活化的重要細胞因子，調控B 細胞的活化、增殖及分化[15]，HT患者血清BAFF 水平升高[15-16]。目前針對B 細胞免疫環節治療AIT 的中醫藥研究相對較少，故本研究探討了益氣養陰消癭方對AIT 模型大鼠BAFF 的調節作用，結果顯示，模型組血清BAFF 水平較正常對照組明顯升高，提示AIT 模型大鼠B 細胞免疫被激活，而益氣養陰消癭方可顯著降低血清BAFF 水平，從而抑制B 細胞活化，提示該方可通過下調BAFF 水平發揮重要的B 細胞免疫調節作用。

IL-10 是一種免疫抑制因子，可以抑制T 淋巴細胞活化[17]，減少甲狀腺組織淋巴細胞浸潤，并一定程度上阻止甲狀腺濾泡細胞的破壞[18]。1 項對91 例HT患者的臨床數據分析顯示其血清IL-10 水平顯著減低，提示HT 患者該細胞因子功能下降[19]。本研究顯示AIT 模型大鼠甲狀腺組織IL-10 水平顯著降低，該結果與既往文獻報道一致[20-21]。Rosser 等[22]研究發現分泌IL-10 的B 細胞具有免疫抑制作用，稱其為調節性B 細胞（Breg 細胞），Breg 細胞能改變T 細胞分化[23]，可通過IL-10 抑制Th1 免疫反應，并間接抑制Th1、Th17 細胞分化[24]，而后者功能紊亂是HT 的重要機制[25]。本研究探索了益氣養陰消癭方對AIT 模型大鼠甲狀腺組織IL-10 表達水平的影響，發現其可顯著增加甲狀腺組織IL-10 的表達，故而推測該方可能通過促進分泌IL-10 的Breg 細胞的生成而發揮免疫調節作用，但尚需進一步實驗驗證。

AIT 可歸屬于中醫“癭病”范疇，多因情志內傷、肝氣郁結，而致脾運失健，脾氣虛弱，津液無以敷布，凝聚為痰，陰津虧虛，血行不暢，瘀血內滯，痰瘀互結，壅結頸部而成。臨床上HT 患者多屬氣陰兩虛證，陳如泉教授以“益氣養陰法”為治則，擬益氣養陰消癭方，由黃芪、白芍、鬼箭羽、穿山龍四味藥組成，方中黃芪為君藥，健脾益氣；白芍為臣，柔肝理氣；佐以鬼箭羽、穿山龍活血通經、消癭散結，全方共奏“益氣養陰、消癭散結”之功效。現代藥理學及實驗研究發現黃芪多糖可提高免疫抑制小鼠Treg 細胞數的比例[26-28]；白芍總苷有利于恢復Th17/Treg 平衡[29]；穿山龍可調節HT 患者外周Th17、Treg 細胞相關細胞因子[30]。這些研究均佐證了益氣養陰消癭方的免疫調節功能。本研究結果顯示益氣養陰消癭方可降低AIT 大鼠TSH、TGAb、TPOAb 水平，改善免疫失衡狀態，可能與其抑制B 細胞活化的機制相關，為其臨床應用提供了更深層的理論依據。