姜黃素類似物L50H8對SKOV3細胞增殖與凋亡的影響及其機制研究*

邱揚，陳龍飛，王曉玉，林紹強

1.江門市五邑中醫院，廣東 江門 529000； 2.佛山市第一人民醫院，廣東 佛山 528010；3.暨南大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510630； 4.暨南大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510630

卵巢癌術后復發及治療失敗的重要原因是癌細胞對化療藥物產生耐藥性，罹患卵巢癌接受規范化治療后仍有62%的患者出現腫瘤復發或處于疾病持續存在狀態[1]。現階段，開發對耐藥癌株有效的新型藥物仍是卵巢癌治療研究中的熱點。姜黃素是從姜黃、郁金等姜科姜黃屬植物根莖中提取出的一種有效成分，具有多種藥理活性，對胃腸道、乳腺及泌尿生殖系統等惡性腫瘤均顯示出一定的抑制作用[2-3]。然而，CUR存在水溶解度低、水溶液易水解、首過消除效應明顯、生物利用度偏低等不足，阻礙其臨床應用[4]。L50H8是一種通過分子結構修飾獲得的CUR類似物，具有更高的穩定性與生物利用度。本研究選擇對順鉑及阿霉素耐藥的卵巢癌細胞株SKOV3為模型，評估L50H8在體外對癌細胞增殖與凋亡的影響，并對其機制作初步探討。

1 材料

1.1 細胞株SKOV3細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。用RPMI1640培養基+10%胎牛血清+雙抗(1×105IU·L-1青霉素+100 mg·L-1鏈霉素)配制成PRMI1640完全培養基，于37 ℃、5%CO2飽和濕度恒溫細胞培養箱中培養，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2 藥品與試劑L50H8由溫州醫科大學藥學院合成并純化。RPMIl640培養基(美國GIBCO公司，批號：C22400500BT)；胎牛血清(中國杭州四季青公司，批號：11011-8615)；Annexin V-FICT/PI細胞凋亡試劑盒(美國BD公司，批號：556507)；蛋白定量檢測試劑盒(南京凱基生物發展有限公司，批號：KGP902)；MTT和DMSO(德國Sigma公司，批號：M5655-1G、D5879)；兔抗人單克隆抗體Bax、Caspase8、cleaved-caspase3、AIF(apoptosis inducing factor)、GRP78(glucose regulated protein 78 kDa)、CHOP(C/EBP-homologous protein)(美國Cell Signaling Technology公司，貨號分別為：2774S、4790S、9664S、5318S、3177S、5554S)；蛋白分子Marker(德國Fermentas公司，貨號：26616)；ECL熒光底物(北京全式金生物技術有限公司，貨號：DW101-02)。

1.3 儀器CO2恒溫培養箱(Thermo Forma，美國)；免疫印跡凝膠成像儀(Eastman Kodak，美國)；倒置顯微鏡(重慶奧特光學，中國)；FACS Canto TMⅡ流式細胞儀(BD，美國)；酶標儀(BIO-RAD，美國)；臺式高速冷凍離心機(Thermo Fisher公司，美國)；6孔培養板(Corning，美國)。

2 方法

2.1 MTT法觀察L50H8對SKOV3細胞增殖的影響將細胞濃度調整為1×107·L-1，接種于96孔板，每孔100 μL，分別加入0 mol·L-1(單位“mol·L-1”以下均縮略為“M”)、0.625 μM、1.25 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM、20 μM和40 μM的L50H8和CUR，每個濃度設3個復孔。加藥后置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱內培養24 h后，每孔加入0.5%的MTT溶液10 μL，繼續培養4 h后，每孔加入Formanzan溶解液100 μL繼續培養4 h，酶標儀檢測570 nm波長處的吸光度(OD)值，計算細胞生長抑制率。實驗重復3次，取平均值。

細胞抑制率=1-(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)

2.2 Annexin V/PI雙染色流式細胞法檢測細胞凋亡將細胞濃度調整為2×108·L-1，經DMSO、20 μM 的CUR、2.5 μM、5 μM、10 μM的L50H8作用24 h后形成各濃度組，1 000 r·min-1離心3 min，棄上清，用PBS洗滌細胞1次，1 000 r·min-1離心3 min，棄上清，加入400 μL的染色緩沖液懸浮細胞，加入Annexin V和Propidium Iodide(PI)各5 μL混勻，室溫避光染色20 min，流式細胞儀分析藥物對SKOV3細胞凋亡的影響。

2.3 Western Blot法檢測細胞凋亡蛋白的表達用DMSO、20 μM的CUR、2.5 μM、5 μM、10 μM的L50H8作用于細胞24 h后形成各濃度組，離心收集細胞，用預冷的0.01M PBS(pH 7.2)洗滌3次，加入去污裂解緩沖液，在冰上用超聲細胞破碎機超聲裂解細胞，離心收集上清蛋白液，BCA法檢測蛋白濃度。各組取相同的蛋白量上樣，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。電泳后轉膜，封閉液封閉，加一抗4℃搖床孵育過夜，TBST洗去未結合的一抗。加二抗(14 000稀釋)室溫搖床孵育2 h。將ECL試劑盒中的A和B試劑等體積混合，滴加到Gel Logic 1500凝膠成像儀上。將 PVDF膜正面朝下，在膜上均勻澆抹ECL發光液，用保鮮膜平整鋪在PVDF膜上，將膠片壓在保鮮膜上，放入膠片機中，依次進行顯影定影。采用Adobe Photoshop CS3軟件對圖像進行灰度分析。

3 結果

3.1 L50H8對SKOV3細胞增殖的影響MTT結果表明，隨著濃度的升高，L50H8和CUR對細胞增殖的抑制率均逐漸上升，呈濃度依賴性，見圖1。相比于CUR，L50H8對細胞的抑制率更高，從最低濃度0.625 μM至最高濃度40 μM，差異均具有統計學意義(P<0.05)。L50H8的IC50為(2.71±0.08) μM，CUR的IC50為(10.27±0.96) μM，差異有統計學意義(P<0.01)。

3.2 L50H8對SKOV3細胞凋亡的影響為了解L50H8對SKOV3細胞的殺傷作用是否與其誘導細胞凋亡相關，采用Annexin V/PI雙熒光染色流式細胞法檢測細胞凋亡率。結果顯示，經DMSO、20 μM 的CUR、2.5 μM、5 μM、10 μM的L50H8處理后的細胞凋亡率分別為：(4.61±1.41)%，(10.06±1.68)%，(12.71±2.30)%，(25.96±2.01)%和(56.57±1.45)%，L50H8各濃度組與 DMSO 組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，L50H8 5 μM組、L50H8 10 μM組與CUR 20 μM組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。上述結果提示L50H8對SKOV3細胞有顯著的凋亡誘導作用，其作用呈濃度依賴性，且強于CUR。見表1，圖2。

注：L50H8與CUR各濃度組抑制率比較,*P<0.05；L50H8與CUR的24 h IC50比較,*P<0.01圖1 L50H8對SKOV3細胞的抑制率曲線

注：R3：晚期凋亡細胞(Annexin V+/PI+)，R5：早期凋亡細胞(Annexin V+/PI-)，細胞凋亡率(%)=(R3+R5)/(R2+R3+R4+R5)×100%圖2 L50H8對SKOV3細胞凋亡率的影響

表1 L50H8對SKOV3細胞凋亡率的影響

3.3 L50H8對SKOV3細胞凋亡調控相關蛋白表達的影響為進一步研究L50H8誘導細胞凋亡的具體其作用機制，用Western Blot法測定Bax、caspase8、cleaved-caspase3與AIF蛋白的表達。結果表明，L50H8能上調促凋亡因子Bax及AIF的表達，其效應呈濃度依賴性，但對caspase8蛋白表達無明顯影響，cleaved-caspase3始終未見表達，見圖3。

3.4 L50H8對SKOV3細胞內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)相關蛋白GRP78和CHOP表達的影響為了解L50H8是否能誘發ERS繼而誘導癌細胞凋亡，采用Western Blot法測定ERS啟動關鍵因子GRP78及前凋亡因子CHOP的表達，結果表明，L50H8能濃度依賴性地上調SKOV3細胞GRP78及CHOP的表達，且作用效果明顯強于CUR，見圖4。

注：A：Western Blot法檢測Bax、caspase8、cleaved-caspase3與AIF蛋白的表達；B：與DMSO組比較，#P<0.05；與CUR 20 μM組比較，#P<0.05圖3 L50H8對Bax、caspase8與AIF表達的影響

注：A：Western Blot法檢測GRP78與CHOP蛋白的表達；B：與DMSO組比較，①P<0.05；與CUR 20 μM組比較，②P<0.05圖4 L50H8對GRP78與CHOP表達的影響

4 討論

近年來，CUR的抗腫瘤作用受到關注。有研究發現CUR可以通過抑制新生血管生成及細胞增殖，誘導癌細胞凋亡，下調表皮生長因子受體EGFR活性以及HER2的表達水平，下調核轉錄因子 NF-κB，抑制STAT3信號通路的激活，下調COX-2的表達水平，降低MMP9和iNOS的合成水平等多種途徑發揮抗腫瘤作用[5]。但CUR分子是對稱的雙羰基結構，該結構穩定性較差。前期研究團隊在保留CUR活性的基礎上對其分子結構進行改造，得到一系列CUR類似物，在其中篩選出穩定性和抗腫瘤活性較佳的L50H8作進一步研究，發現L50H8對肺腺癌細胞A549具有良好的增殖抑制效應，IC50為2.83 μmol·L-1。為了解該藥物對卵巢癌細胞的作用，本課題組將其作用于SKOV3細胞，發現L50H8對該細胞同樣具有顯著的抑制作用，且抑制活性明顯優于CUR，24 h的IC50低于CUR的1/3，與其在肺腺癌細胞A549的IC50接近。

細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種重要過程，能否誘導腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤藥物研究的重要觀察項目之一。已有研究證實CUR能誘導SKOV3細胞凋亡[6]。本研究發現，作為CUR類似物的L50H8同樣具有促進SKOV3細胞凋亡的作用，且其效應強于其母體CUR。線粒體途徑是細胞凋亡調控的重要機制，該機制被觸發時，線粒體內膜的通透性孔道開放使線粒體內膜通透性增加，細胞色素c等物質釋放入胞質，觸發細胞凋亡級聯反應[7]。在該機制中，B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白家族成員發揮關鍵作用，正常情況下，該家族中的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl與線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道結合，促使線粒體基質中的質子外流以及ATP/ADP在線粒體與細胞質之間相互交換，形成正常離子通道，維持線粒體的生理功能。當線粒體凋亡機制被觸發時，線粒體內外膜之間的通透性轉換孔將Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax集中到自身周圍，使通道孔徑增大，令該非選擇性通道持續開放，使跨內膜的氫離子梯度消失、呼吸鏈解偶聯，接續活化下游caspase家族成員如caspase8、caspase9、caspase3等發生級聯反應，誘導細胞凋亡[8]。另外，Bax也可通過激活AIF引起核內DNA凝集并斷裂，引起非典型的細胞凋亡。AIF是一種具有雙重功能的黃素蛋白，主要存在于線粒體內外膜間隙中，當細胞在正常生理狀態時，AIF作為線粒體氧化還原酶催化細胞色素c和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸之間的電子傳遞，既參與線粒體組成，又在能量代謝方面扮演重要角色；當細胞受到凋亡刺激時，AIF能在不依賴caspase凋亡因子的情況下，經蛋白酶水解形成 57 kD 的成熟AIF，釋放入胞質中，經由自身的氧化還原區及親環素A的輔助作用轉位入核，引起染色體凝聚及DNA片段化，使細胞發生凋亡[9-10]。區俊文等[11]發現，CUR能使三陰乳腺癌細胞凋亡率增加，Bax、caspase9、caspase3蛋白表達增強；張啟明等[12]發現，CUR能通過上調caspase8 mRNA、Bax、cleaved-caspase9及cleaved-caspase3蛋白表達水平促進視網膜母細胞瘤細胞凋亡；徐秀鵬等[13]發現，CUR能通過增加Bax mRNA和AIF mRNA的表達、活化caspase3和AIF蛋白促進腎癌細胞凋亡。本研究結果與上述研究結果有所不同，L50H8能上調SKOV3細胞Bax及AIF蛋白的表達，但對caspase8的表達無明顯影響，活化凋亡效應分子cleaved-caspase3始終未見表達，提示L50H8對SKOV3細胞的凋亡誘導效應不依賴于線粒體caspase通路，主要通過上調Bax、激活AIF途徑實現。與其他研究結果存在差異性的原因可能在于L50H8與其母體CUR分子結構上的差異，以及藥物所針對的腫瘤細胞株不同，確切原因有待進一步探究。

ERS是繼線粒體途徑和死亡受體途徑后發現的另一細胞凋亡途徑。內質網內環境保持穩態是內質網發揮正常功能的先決條件。細胞具有保障內質網對蛋白質進行正常折疊與修飾的監督糾錯機制，當錯誤折疊的異常蛋白質發生累積，細胞啟動未折疊蛋白反應，包括加強蛋白質折疊、阻斷多數蛋白質的翻譯、加快異常蛋白質的降解等。若內質網功能紊亂持續，細胞最終將激活凋亡程序誘導自身凋亡。因ERS會引發內質網內折疊異常蛋白質的堆積，故與未折疊蛋白反應相關的因子增多常提示ERS的發生。GRP78是一種分子伴侶，屬于熱休克蛋白70家族成員，在蛋白質折疊與轉運以及ERS反應中具有關鍵作用。在ERS中，GRP78扮演內質網穩態感受器的重要角色，當ERS發生時，GRP78表達增多并可通過3個內質網跨膜蛋白啟動其下游的信號分子CHOP蛋白表達增加而誘導細胞凋亡，故GRP78是ERS啟動的關鍵因子之一。一般認為，GRP78表達增加可作為ERS發生的分子標記物[14]。CHOP是一種特異性ERS轉導因子[15]，是ERS過程中由抗凋亡向促凋亡轉換的重要信號分子[16]，屬于前凋亡因子，具有直接誘導細胞凋亡的活性[17]。有研究發現，CUR能通過ERS通路，上調GPR78和CHOP蛋白表達誘導肝癌[18]和肺癌[19]細胞凋亡。本研究發現，L50H8同樣能使SKOV3細胞GRP78及CHOP蛋白表達增強，誘發ERS導致細胞凋亡；CUR雖然也能一定程度上調GRP78和CHOP表達，然其表達強度不及L50H8。

綜上，L50H8能顯著地抑制SKOV3細胞增殖、誘導細胞凋亡，其凋亡誘導效應可能通過上調Bax、激活AIF以及誘發ERS實現，但不依賴于線粒體caspase通路。