旋覆花治療胃食管反流病作用機制的網絡藥理學研究*

張淵，喻斌

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208； 2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是指胃內容物反流造成的一系列癥狀及并發癥，通常反流至食管、咽喉，也有部分患者可反流至氣管和肺[1]。臨床多表現為反酸、胃灼熱、吞咽困難等消化道癥狀[2]，也有表現為慢性咳嗽、哮喘，或咽部異物感、聲嘶等，也可導致食管及胃食管癌變[3]。由于現代社會工作節奏快，飲食習慣、生活習慣不規律，精神壓力大，導致該病在城市發病率明顯升高[4]。該病起病隱匿，發病機制復雜，臨床上以抑酸護胃為主，因臨床癥狀多，用藥常伴隨藥物不良反應，患者依從性低等問題。

中醫根據臨床癥狀，將GERD歸屬于“食管癉”“噫醋”“吐酸“等范疇[5]?！杜R證指南醫案·脾胃》曰：“脾宜升則健，胃宜降則和”。若因飲食、勞倦、情志所傷，致使中焦土虛木旺、或痰阻氣逆、脾胃氣機升降失調、胃氣不降反逆，出現反酸、胃灼熱等，發生GERD。該病關鍵病機主要在于胃失和降、胃氣上逆[6]，治療多以“和胃降逆”為主，并隨癥加減。臨床常用旋覆花、枳殼、厚樸、代赭石等降胃氣，或用大黃、沉香、烏藥等通降腑氣的中藥。名中醫周亨德在治療GERD時常取旋覆花配合代赭石、姜半夏等和胃降逆[7]。筆者在跟隨導師喻斌教授學習過程中發現，老師運用旋覆花治療胃氣逆導致的噯氣、嘔吐、反酸等及肝氣逆導致的脅痛有一定療效。

旋覆花為菊科植物旋覆花或歐亞旋覆花的頭狀花序，在《神農本草經》中稱之為“金沸草”，味苦、辛、咸，性溫，歸肺、大腸經，具有降氣、消痰、行水的功效。清代黃元御《長沙藥解》中言：“凡草木之味，咸者絕少。咸皆治下，咸而能治上焦者尤少。惟此味咸而治上，為上中二焦之藥”。運用旋覆花降之特性來治療胃氣上逆之證，符合中醫辨證施治的特點。旋覆花的化學成分主要有倍半萜類、黃酮類和糖類，其具有抗炎、抗細胞增殖、抗氧化等藥理作用。但旋覆花治療GERD的具體作用機制少見報道。因此，本文采用網絡藥理學方法分析旋覆花治療GERD作用機制，為其在臨床的應用提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 資料網絡圖像化軟件Cytoscape(3.7.0版)；蛋白質相互作用平臺(UniProt數據庫，https：//uniprot.org/)；中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP，http：tcmspw.com/tcmsp.php)；功能性蛋白連接網絡數據庫STRING(11.0版本，https：//string-db.org/cgi/input.pl)；注釋、可視化和整合發現數據庫(DAVID 6.8，https：//david.ncifcrf.gov/)；藥物銀行(DrugBank，https：//www.drugbank.ca/)；在線人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM)；治療靶點數據庫(TTD)；Genecards數據庫(https：//www.genecards.org/)。

1.2 方法

1.2.1 旋覆花的活性成分篩選及其作用靶點預測 在TCMSP數據庫，以“旋覆花”為關鍵詞進行檢索，設置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)值≥30%、藥物類藥性(drug-likeness，DL)值≥0.18，獲得旋覆花的活性成分。點擊進入“Related Targets”界面，獲得旋覆花活性成分對應的作用靶點。在Uniprot數據庫中將作用靶點的名稱轉化為基因名。運用Cytoscape軟件構建中藥活性成分-預測靶點網絡圖，以“節點”表示活性成分和預測靶蛋白，以“邊”表示成分與靶點之間的作用關系，可視化分析活性成分-預測作用靶點相互作用的關系。

1.2.2 檢索GERD的相關靶點 以“Gastroesophageal Reflux”和“Gastro esophageal Reflux Disease”為關鍵詞，在DrugBank、OMIM、TTD、GeneCards數據庫檢索當前已知的與GERD發病明確相關的基因靶點。

1.2.3 構建旋覆花-GERD靶點蛋白互作網絡(PPI)和篩選關鍵基因(Hub) 將1.2.1所得的藥物預測作用靶點和1.2.2所得的GERD疾病靶點分別導入STRING數據庫，選擇對象為“Homo sapiens”，對蛋白互作拓撲結構基因節點進行拓展，建立PPI互作網絡。運用Cytosecape軟件中的“merge”功能，將上述得到的兩個網絡提取交集，得到旋覆花治療GERD直接或間接靶標蛋白及其互作網絡。運用Cytoscape軟件中的“cytohubba”插件，對旋覆花治療GERD直接或間接靶標蛋白互作網絡采用MCC、MNC、中心度值及中介中心性值算法，選“Top10”，分別獲得得分前10的基因，并對這4組基因取交集，即為旋覆花治療GERD的關鍵靶點(Hub基因)。

1.2.4 旋覆花治療GERD靶標蛋白GO分析及KEGG通路富集分析 在DAVID數據庫，對1.2.3所得Hub基因進行GO功能分析及KEGG通路分析(P<0.01)，篩選顯著性的基因并作圖。運用Cytoscape將符合條件的通路可視化，得到Hub基因-通路網絡圖，運用“merge”將此圖與1.2所得的活性成分-預測靶點網絡圖合并，得到中藥活性成分-關鍵靶點-通路網絡。

2 結果

2.1 旋覆花的藥物活性成分在TCMSP數據庫，搜索得到符合條件的旋覆花活性化合物共19種，預測作用靶點393個，主要包括紅車軸草素(Pratensein)、異鼠李素(isorhamnetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、棕櫚酸香樹脂醇酯(amyrin Palmitate)、異熱馬酮(isoramanone)、檉柳黃素(tamarixetin)、旋覆花次內酯(inulicin)3-[(3aS，4R，5R，8aR)-4-羥基-5，7-二甲基-3-亞甲基-2-氧代-4，5，8，8a-四氫-3aH-環庚基[b]呋喃-6-基]乙酸丙酯(3-[(3aS，4R，5R，8aR)-4-hydroxy-5，7-dimethyl-3-methylene-2-oxo-4，5，8，8a-tetrahydro-3aH-cyclohepta[b]furan-6-yl]propyl acetate)、[(3aR，4R，7aR)-5-[(1S)-4-乙酰氧基-1-甲基丁基] -6-甲基-3-亞甲基-2-氧代-3a，4，7，7a-四氫苯并呋喃-4-基]乙酸酯[(3aR，4R，7aR)-5-[(1S)-4-acetoxy-1-methyl-butyl]-6-methyl-3-methylene-2-oxo-3a，4，7，7a-tetrahydrobenzofuran-4-yl] acetate等(表1)。

表1 旋覆花的活性成分

2.2 旋覆花活性成分及其預測靶點可視化分析運用Cytoscape軟件構建活性成分-預測靶點網絡圖(圖1)。該圖顯示共203個節點(活性成分節點共16個和預測靶共187個)和393條邊，其中粉色代表活性成分，藍色代表預測靶點，每條邊表示活性成分與預測靶點相互作用關系。預測靶點按度值排列分為3圈(由外向內，度值由小到大)。度值作為網絡中關鍵節點的標準之一，表2列舉了圖2 網絡中的重要節點(度值>10)及其拓撲參數。

注：粉色代表活性成分，藍色代表預測靶點圖1 中藥活性成分-預測靶點網絡圖

表2 活性成分-預測靶點網絡圖關鍵節點及其拓撲學參數

2.3 構建旋覆花治療GERD的靶點蛋白互作網絡(PPI)在DrugBank、OMIM、TTD及Genecards數據庫分別搜索與疾病發病相關基因分別為109、394、7、181個，剔除重復基因后，篩選得到353個與GERD發病密切相關的靶點。將旋覆花活性成分對應的預測作用靶點和GERD發病相關靶點產STRING數據庫中進行拓撲結構擴展，得到預測作用靶點PPI網絡和與GERD發病相關靶點PPI網絡。前者顯示拓展后直接或間接預測作用靶點有706個，相互作用關節有8 543個；后者顯示拓展后與GERD發病相關直接或間接作用靶點有846個，相互關系為7 851個。運用Cytoscape軟件提取兩個網絡的交集，得到旋覆花治療GERD作用靶點PPI 網絡(圖2)，刪除與主網絡不關聯的靶點后，網絡顯示靶點數有138個，相互作用關系數為859條。圖中靶點按度值分度(最外圈為1～9，左側小圈為10～39，右側小圈為40～60，度值越大，靶點節點直徑越大)。

2.4 篩選旋覆花治療GERD的Hub基因運用Cytoscape軟件的“Cytohubba”插件中的MCC、MNC、中心度性及中介中心性值算法，分別獲得靶點互作網絡圖(圖2)的關鍵網絡，提取4個網絡的交集(表3)，獲得8個節點和28個相互作用關系(圖3)。圖示的8個靶點即為旋覆花治療GERD的關鍵靶點(Hub基因)。

圖2 旋覆花治療GERD作用靶點網絡圖

圖3 旋覆花治療GERD的關鍵靶點網絡

表3 Cytohubba插件篩選Hub基因表格

2.5 Hub基因的GO功能分析及KEGG通路分析對Hub基因進行GO功能分析和KEGG通路分析顯示，8個靶點共與80個生物學過程和57條信號通路有關，根據P<0.01進行篩選，得到37個生物學過程與36條信號通路。旋覆花治療GERD主要涉及調節轉錄、細胞增殖、ERK1和ERK2級聯、改善基因表達、一氧化氮生物合成過程、MAP激酶活性、蛋白激酶B信號傳導、RNA聚合酶II啟動子轉錄、細胞凋亡、衰老、調節脂質貯存、血管生成、線粒體膜通透性的調節、MAPK級聯、連環蛋白進入細胞核及對脂多糖反應等生物學過程(圖4)。

注：X軸是Generatio，Y軸是生物過程名稱，氣泡顏色代表P值，氣泡大小代表富集基因數Count圖4 GO功能富集分析-生物過程氣泡圖

KEGG通路分析結果主要富集在丙型肝炎、乙型肝炎、癌癥信號通路、膀胱癌、炎癥性腸病、胰腺癌、百日咳、MAPK信號通路、類風濕性關節炎、HIF-1 信號通路、美洲錐蟲病、Toll樣受體信號通路、FoxO 信號通路、非酒精性脂肪肝、甲型流感、單純皰疹感染、癌癥中的蛋白多糖、瘧疾、子宮內膜癌、軍團菌感染、NOD樣受體信號通路、非小細胞肺癌、人嗜T淋巴細胞病毒感染、膠質瘤、幽門螺桿菌感染的上皮細胞信號轉導等方面，與旋覆花治療GERD的潛在靶標的相關性明顯。

運用Cytoscape軟件繪制通路-靶點網絡，將之與預測2.2所得的活性成分-預測靶點合并，得到中藥活性成分-關鍵靶點-通路網絡(圖5)，圖中顯示8個作用靶點，4個活性成分與36個通路及150條相互作用關系。

注：藍色代表通路名；綠色代表活性成分；紅色代表關鍵靶點圖5 中藥成分-靶點-通路網絡圖

3 討論

本研究運用網絡藥理學的方法對旋覆花治療GERD的作用機制進行研究，通過對中藥活性成分-關鍵靶點-通路網絡進行分析發現，旋覆花的有效活性成分是槲皮素、毛地黃黃酮、β-谷甾醇、山柰酚等。槲皮素和山柰酚都屬于植物類黃酮，且都具有降低損傷引起的氧化應激的特性[8-9]。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，有研究表明[10]，其可增強機體清除氧自由基的能力，可抑制炎性因子的釋放與聚集來保護胃食管黏膜。毛地黃黃酮，又稱木犀草素，其可下調NF-κB等多種炎癥因子的表達[11]。NF-κB信號通路的激活及上調各種炎癥因子水平，是導致GERD發生的一個重要原因。故筆者推測，旋覆花可能是通過抑制食管黏膜下炎癥因子表達，提高胃食管黏膜防御能力從而阻止反流發生。

旋覆花治療GERD的治療的關鍵靶點分別為JUN、STAT3、TP53、TNF、IL-6、CXCL8、EGFR和EGF。腫瘤壞死因子(TNF)參與多種炎癥疾病，能通過多種效應激活 NF-κB信號通路，使炎癥活躍，導致食管和胃食管黏膜癌變[12]。白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)可在胃食管反流等慢性炎癥環境中協同白細胞介素-8(IL-8)、表皮生長因子(EGFR)、表皮生長因子(EGF)等炎癥因子構建炎癥網絡[13]；信號傳導蛋白和轉錄激活物(STAT3)在炎癥網絡中起關鍵作用—催使慢性炎癥腫瘤化及促進腫瘤內血管新生與轉移[14]；JUN在控制細胞惡變方面具有重要作用；TP53突變是胃癌最常見的基因突變之一[15]。相關研究發現，旋覆花中分離出的倍半萜內酯二聚體(XFH-31)可以阻斷TNF-ɑ激活 NF-κB、MAPKs信號通路[16]，下調 IL-6 等炎癥因子并阻止STAT3介導的腫瘤發生和轉移。

根據GO分析的結果，旋覆花抗GERD的作用機制主要集中于抑制炎性細胞增殖、促進凋亡、改善基因表達、抑制一氧化氮合成和調節免疫應答等，同時還與炎癥細胞的代謝密切相關。除化學損傷、炎癥反應與免疫反應外，胃食管交界產生的一氧化氮到達細胞毒性濃度也可能促使GERD發生與惡化[17]。為進一步了解旋覆花治療GERD可能性的通路，繼續對關鍵靶點行KEGG通路分析。結果顯示，在所有通路中，富集基因較多且與胃食管反流病機制關系較密切的有HIF-1信號通路、MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路、與癌癥相關的通路、NOD樣受體信號通路和幽門螺桿菌感染的上皮細胞信號轉導通路等。

胃酸或膽汁反流可導致胃食管黏膜血管受損，局部缺氧、缺血，易引起黏膜糜爛和潰瘍，血管再生對于損傷部位的修復尤為重要。缺氧誘導因子-1(HIF-1)可維持細胞在低氧環境內存活，在胃食管疾病中HIF-1可激活血管內皮生長因子(VEGF)，加速血管新生，促進損傷黏膜的愈合[18]；另在腫瘤疾病中HIF-1也可加速腫瘤微環境內的血管新生，加速腫瘤侵襲與轉移[19]。Calvino等[20]研究發現，旋覆花提取物具有抗腫瘤微環境內新血管生成的作用。故筆者推測，旋覆花可能通過調控HIF-1通路影響相關因子，起到修復胃食管黏膜及阻止黏膜病變惡化的作用，但具體機制有待進一步研究。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)具有促進炎性細胞增殖、抑制凋亡等作用，包括ERK、JNK和p38三個亞族。在胃食管反流病發病機制中，p38MAPK信號通路被TNF-ɑ、酸性環境刺激或上游Toll樣受體信號通路激活后，上調IL-6、IL-8、IL-33、TNF-ɑ等炎癥因子，刺激誘導性一氧化氮合酶合成一氧化氮，導致GERD發生與惡化[21]。Toll 樣受體(TLRs)與NOD樣受體(NLRs)都是模式識別受體(PRRs)家族成員，TLRs分布于膜表面，參與細胞凋亡及免疫激活。NOD樣受體在人體上皮細胞和免疫細胞的胞質中廣泛存在，可介導多種免疫和炎癥反應發生。Nadatani等[22]研究發現，胃食管反流病程中，屬于癌前病變的Barrett食管形成機制中，NLRP3炎性小體的形成發揮重要作用。TLRs可激活NF-κB通路，介導相關因子聚集形成炎癥小體，形成Caspase-1，上調IL-8等炎癥因子，從而引起炎癥效應。Abdel-Latif等[23]研究發現，幽門螺旋桿菌提取物(HPE)能誘導食管上皮細胞內NF-κB和AP-1高表達，可能間接引起賁門和食管遠端的炎癥。GERD的發生與NF-κB通路的激活導致炎癥因子上調密切相關；王笑晴[24]研究發現，旋覆花中分離出的化合物JEUD-38可顯著抑制ERK、JNK和p38磷酸化，阻斷NF-κB和MAPK通路激活從而減少微生物脂多糖誘導的一氧化氮合酶表達和炎癥因子分泌。而筆者在研究過程中，發現在旋覆花治療GERD相關通路中富集靶點最多是與癌癥相關的通路。GERD可引起食管上皮中細胞周期調控基因及抑癌基因(尤其是P35)的突變，從而導致細胞增殖、分化異常[25]，引起食管及食管癌變。TOKGUN等[26]發現，旋覆花提取物可通過P35引起細胞凋亡，對人乳腺癌MCF-7細胞產生毒作用，從而抑制腫瘤。故筆者推測，旋覆花可能通過調控癌癥相關通路，影響p35基因表達，從而影響胃食管反流發生或阻斷胃食管黏膜癌變。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學分析預測旋覆花治療GERD作用機制，篩選藥物與疾病相互作用關鍵靶點，運用關鍵靶點分析作用機制，一定程度上減少了數據處理的工作量，且使網絡可視化更加清晰簡潔。本研究通過構建“活性成分-關鍵靶點-通路網絡”，發現旋覆花治療GERD可能通過槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、毛地黃黃酮等活性成分作用于 JUN、STAT3、TP53、TNF、IL6、CXCL8、EGFR 和EGF等關鍵靶點及調節HIF-1信號通路、MAPK 信號通路、Toll 樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路及與癌癥相關等信號通路發揮直接或間接的治療作用，主要集中于促進細胞凋亡、下調炎癥因子、調控血管生成、抑制細胞增殖和一氧化氮生成、阻止黏膜病變惡化等方面。