lncRNA CASC19通過miR-152-3p上調HMGA2影響骨肉瘤發生發展的機制研究

符泰勝 劉春勇

骨肉瘤是一種原發的骨惡性腫瘤，其惡性程度高、轉移早、預后差，靶向治療是可直接靶向特定位點提高腫瘤局部治療效果，同時減少對健康組織的毒性反應，部分靶向藥物在骨肉瘤的臨床應用中已經取得一定療效，尋找開發更多的靶點和靶向藥物對骨肉瘤的靶向治療具有重要意義[1,2]。研究表明，lncRNA對miRNA具有海綿吸附作用，可作為一種競爭性的內源性RNA與miRNA相互作用，共同參與靶向基因的調控，從而參與腫瘤發生發展過程[3]。癌癥易感基因19(cancer susceptibility 19，CASC19)是一種lncRNA，結直腸癌組織中CASC19高表達，其與腫瘤的大小、淋巴結轉移及遠處轉移顯著相關[4]。CASC19過表達通過靶向miR-140-5p上調細胞遷移誘導透明質酸酶1(cell migration inducing hyaluronidase 1，CEMIP)增強了結直腸癌細胞的侵襲，遷移和增殖[5]。研究發現，骨肉瘤組織中miR-152低表達，與Enneking分期、轉移相關，是影響骨肉瘤患者預后的獨立危險因素[6]。miR-152-3p通過靶向調控轉錄因子4(transcription factor 4，TCF4)抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖并誘導細胞凋亡[7]。LINC00174通過使miR-1523-3p海綿化并增加溶質載體家族2促葡萄糖轉運蛋白成員1(solute carrier family 2/facilitated glucose transporter,member 1，SLC2A1)表達促進神經膠質瘤的癌變[8]。研究報道miR-490-3p通過靶向高遷移率族蛋白A2(high mobility group protein AT-hook2，HMGA2)能顯著抑制骨肉瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡[9]。miR-106a-5p上調可通過靶向骨肉瘤細胞中的HMGA2抑制細胞增殖，遷移和侵襲[10]。然而CASC19對骨肉瘤發生發展的應收及其機制尚不清楚，本實驗旨在研究CASC19是否通過調控miR-1523-3p/HMGA2影響骨肉瘤的發生發展。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 人成骨細胞hFOB 1.19和骨肉瘤細胞Saos2、U2OS、HOS購自美國ATCC；胎牛血清、DMEM-F12培養基、RPMI-1640培養基均購自美國Gibco公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自美國Progema公司；載體質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；細胞計數試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8)、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購自北京Solarbio公司；蛋白提取試劑盒、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)試劑盒購自美國Bio-Rad公司；抗體均購于美國Abcam公司；熒光素酶報告基因試劑盒和報告基因載體均購自美國Promega公司；Thermo FC酶標儀購自美國Thermo公司；FACSCanto II流式細胞儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養與轉染 人成骨細胞hFOB 1.19置于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養液中，骨肉瘤細胞Saos2、U2OS、HOS置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，在37℃、5% CO2培養箱中培養。取對數生長期細胞Saos2，消化后接種于6孔板內，培養24 h后按照LipofectamineTM2000試劑盒說明進行轉染，將si-NC、si-CASC19、pcDNA-NC、pcDNA-CASC19、miR-NC、miR-152-3p、anti-miR-NC、anti-miR-152-3p轉染至Saos2中，記為si-NC組、si-CASC19組、pcDNA-NC組、pcDNA-CASC19組、miR-NC組、miR-152-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-152-3p組；將si-CASC19分別與anti-miR-NC、anti-miR-152-3p共轉染至Saos2中，記為si-CASC19+anti-miR-NC組、si-CASC19+anti-miR-152-3p組；將si-CASC19、anti-miR-152-3p分別與si-NC、si-HMGA2共轉染至Saos2中，記為si-CASC19+anti-miR-152-3p+si-NC組、si-CASC19+anti-miR-152-3p+si-HMGA2組。

1.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測lncRNA CASC19、miR-152-3p、HMGA2 mRNA表達水平 各組細胞培養48 h，提取總RNA，檢測RNA濃度及純度，逆轉成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR，每個樣品設3個重復，循環條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；72℃延長5 min。相對表達量用2-△△Ct法計算。CASC19和HMGA2以GAPDH為內參，miR-152-3p以U6為內參，CASC19上游引物序列：5’-GAGGAAGGCAGCACAATGATG-3’，下游引物序列：5’-CTTGCCAGTGTCTTCTCCTGA-3’；HMGA2上游引物序列：5’-CCCAAAGGCAGCAAAAACAA-3’，下游引物序列：5’-GCCTCTTGGCCGTTTTTCTC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游引物序列：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’；miR-152-3p上游引物序列：5’-ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACTG-3’，下游引物序列：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCA-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4 蛋白質印跡(Western blot)法檢測HMGA2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達 提取細胞總蛋白并用BCA試劑盒進行蛋白定量。取50 μl蛋白樣品于10%的SDS-PAGE轉至PVDF上，用5 %的牛血清蛋白封閉1 h。加入一抗4℃過夜，TBST洗膜3次；加入二抗室溫培養1 h，再用TBST洗滌3次，加入化學發光試劑顯影，成像后用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度水平，蛋白表達水平=目的條帶和β-actin條帶的比值。每個蛋白樣品設3個重復，實驗重復3次。

1.5 CCK-8檢測細胞活性 選擇各組轉染后培養48 h 的細胞，每孔中加入10 μl CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標儀檢測各組細胞490 nm波長處的吸光度值(OD)。細胞活性(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞培養48 h后用預冷的PBS漂洗2次，加入500 μl的結合緩沖液混勻。先加入10 μl的Annexin V-FITC室溫避光孵育15 min，然后在上機前5 min再加入5 μl的PI進行染色，混勻后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每管樣品重復檢測3次，每組設3個復孔。

1.7 雙熒光素酶報告實驗驗證 CASC19和miR-152-3p以及miR-152-3p和HMGA2的靶向關系 構建含有miR-152-3p結合位點的lncRNA CASC19和HMGA2野生型及突變型報告基因載體，將其分別與miR-NC、miR-152-3p通過Lipofectamine 2000脂質體法共轉染至Saos2細胞中，轉染48 h后，根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 在骨肉瘤細胞系中，lncRNA CASC19、miR-152-3p、HMGA2表達情況 相較于人成骨細胞hFOB 1.19，骨肉瘤細胞Saos2、U2OS、HOS中lncRNA CASC19表達水平升高，miR-152-3p表達水平下降，HMGA2 mRNA和蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western Blot檢測HMGA2蛋白的表達

表1 骨肉瘤細胞系中lncRNA CASC19、HMGA2和miR-152-3p表達量

2.2 低表達lncRNA CASC19對骨肉瘤細胞Saos2增殖和凋亡的影響 相較于si-NC組，si-CASC19組骨肉瘤細胞Saos2中lncRNA CASC19表達水平降低，HMGA2表達水平降低，CyclinD1表達水平降低，Cleaved-caspase-3表達水平升高，細胞存活率降低，細胞凋亡率升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 低表達lncRNA CASC19對骨肉瘤細胞Saos2增殖和凋亡的影響；A 流式細胞儀檢測骨肉瘤細胞凋亡；B Western Blot檢測HMGA2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

表2 低表達lncRNA CASC19對骨肉瘤細胞Saos2增殖和凋亡的影響

2.3 高表達miR-152-3p對骨肉瘤細胞Saos2增殖和凋亡的影響 相較于miR-NC組，miR-152-3p組骨肉瘤細胞Saos2中miR-152-3p表達水平升高，HMGA2表達水平降低，CyclinD1表達水平降低，Cleaved-caspase-3表達水平升高，細胞存活率降低，細胞凋亡率升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3，表3。

表3 高表達miR-152-3p對骨肉瘤細胞Saos2增殖和凋亡的影響

圖3 Western Blot檢測HMGA2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

2.4 lncRNA CASC19靶向miR-152-3p，miR-152-3p靶向HMGA2 通過Starbase軟件預測顯示CASC19可直接靶向結合miR-152-3p，miR-152-3p可直接靶向結合HMGA2。雙熒光素酶報告基因驗證結果顯示，共轉染miR-152-3p和野生型CASC19和HMGA2的載體時，熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)，而共轉染miR-152-3p和靶向突變的CASC19和HMGA2的載體時，miR-152-3p對熒光素酶活性的抑制作用喪失。抑制CASC19表達后miR-152-3p表達水平升高(P<0.05)，過表達CASC19后miR-152-3p表達水平下降(P<0.05)；過表達miR-152-3p，HMGA2表達水平下降(P<0.05)，抑制miR-152-3p表達，HMGA2表達水平升高(P<0.05)。見表4～7,圖4。

圖4 lncRNA CASC19靶向miR-152-3p，miR-152-3p靶向HMGA2;A starbase預測miR-152-3p和CASC19的靶向關系；B starbase對HMGA2和miR-152-3p的預測示意圖；C Western Blot檢測HMGA2蛋白的表達

表4 miR-NC或miR-152-3p與CASC19野生型及突變型報告質粒共轉染Saos2細胞后雙熒光素酶活性檢測

表5 qRT-PCR檢測miR-152-3p的表達

表6 miR-NC或miR-152-3p與HMGA2-3’UTR野生型及突變型報告質粒共轉染Saos2細胞后雙熒光素酶活性檢測

表7 Western Blot檢測HMGA2蛋白的表達

2.5 低表達miR-152-3p可以部分逆轉CASC19低表達對Saos2增殖和凋亡的影響 相較于si-CASC19+anti-miR-NC組，si-CASC19+anti-miR-152-3p組Saos2細胞中miR-152-3p表達水平降低，CyclinD1表達水平升高，Cleaved-caspase-3表達水平降低，細胞存活率升高，細胞凋亡率降低，差異均有統計學意義(P<0.05)見圖5，表8。

圖5 Western Blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

表8 敲減miR-152-3p可以部分逆轉CASC19低表達對Saos2增殖和凋亡的影響

2.6 低表達HMGA2可以逆轉因敲減miR-152-3p對CASC19低表達逆轉的影響 與si-CASC19+anti-miR-152-3p+si-NC組相比，si-CASC19+anti-miR-152-3p+si-HMGA2組HMGA2表達水平降低，CyclinD1表達水平降低，Cleaved-caspase-3表達水平升高，細胞存活率降低，細胞凋亡率升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖6，表9。

表9 低表達HMGA2可以部分逆轉因敲減miR-152-3p對CASC19低表達逆轉的影響

圖6 Western Blot檢測HMGA2、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

3 討論

研究表明，lncRNA和miRNA通過相互作用參與表觀遺傳、轉錄及轉錄后調控，參與惡性腫瘤的發生發展[11]。研究報道lncRNA CASC19與晚期胃癌的進展和預后有關，敲低CASC19抑制了體外胃癌細胞的增殖和遷移[12]。CASC19在非小細胞肺癌組織和細胞系中上調表達，高表達CASC19的患者生存率較差；CASC19通過mi-130b-3p調節ZEB2促進非小細胞肺癌的增殖，遷移和侵襲[13]。本實驗結果顯示，骨肉瘤細胞系中lncRNA CASC19高表達；CASC19低表達，CyclinD1表達水平降低，Cleaved-caspase-3表達水平升高，細胞存活率降低，細胞凋亡率升高。說明CASC19低表達抑制骨肉瘤細胞增殖，促進細胞凋亡。且本實驗還發現CASC19靶向負調控miR-152-3p。

miRNA主要通過與靶mRNA的3’端非翻譯區(3’ UTR)完全或部分互補結合，調控靶基因的表達，調節細胞增殖與凋亡影響腫瘤發生發展[14]。研究報道miR-152-3p通過抑制Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor 4，KLF4)表達在前列腺癌中發揮抑癌作用[15]。miR-152-3p通過靶向細胞周期蛋白依賴性激酶8(Cyclin-dependent kinase 8，CDK8)抑制節肝癌的發生[16]。lncRNA H19通過靶向miR-152-3p抑制溴結構域結合蛋白4(bromodomain containing protein 4，BRD4)介導的細胞增殖來抑制多發性骨髓瘤的發生[17]。本實驗結果顯示，骨肉瘤細胞系中miR-152-3p低表達，miR-152-3p高表達抑制骨肉瘤細胞增殖，促進細胞凋亡。且CASC19靶向調控miR-152-3p，miR-152-3p低表達逆轉了CASC19低表達對Saos2增殖和凋亡的影響。提示，CASC19可能通過調控miR-152-3p的表達影響骨肉瘤細胞的增殖、凋亡。

已有的研究表明，HMGA2參與骨肉瘤的發生發展[9,10]；且研究報道miR-98的確通過與HMGA2結合來抑制乳腺癌細胞的增殖，侵襲，遷移并促進其凋亡[18]。實驗結果顯示，骨肉瘤細胞中HMGA2高表達，表明HMGA2確實與骨肉瘤的發生發展相關。研究表明lncRNA可通過競爭結合miRNA,調控miRNA的靶mRNA[19]。如lncRNA NEAT1通過miR-98-5p調控HMGA2影響前列腺癌的進展[20]。本研究中雙熒光素酶報告基因實驗證實了CASC19靶向負調控miR-152-3p，而miR-152-3p靶向負調控HMGA2。且低表達HMGA2逆轉了因敲減miR-152-3p對CASC19低表達逆轉的影響。以上資料均提示，CASC19可能通過miR-152-3p調節HMGA2的表達而影響骨肉瘤的增殖、凋亡。