LncRNA MFI2-AS1靶向miR-331-3p調節LPS誘導的心肌細胞損傷

雷肖蠢 張海良 丁鵬

膿毒癥是臨床常見的一種全身性炎癥疾病之一，嚴重時可引發心臟等多器官功能障礙，但關于其發病機制尚未闡明[1]。既往研究顯示炎性反應與心肌細胞過度凋亡是促使心肌損傷的重要原因[2-4]。研究表明脂多糖(lipopolysacharide，LPS)可與心肌細胞表面相關受體結合而促進炎性反應的發生從而造成心肌細胞功能障礙，其可用于建立體外心肌細胞損傷模型[5]。因而深入探究心肌細胞損傷機制有助于改善患者預后。長鏈非編碼RNA MFI2-AS1(Long non-coding RNA MFI2-AS1，LncRNA MFI2-AS1)在LPS誘導的軟骨細胞中呈高表達，敲低MFI2-AS1表達可抑制骨關節炎進展[6]。生物信息學分析顯示微小RNA-331-3p(microRNA-331-3p，miR-331-3p)可能是MFI2-AS1的靶基因，研究表明miR-331-3p在胰腺癌發生過程中發揮癌基因作用[7]。但MFI2-AS1是否靶向miR-331-3p參與心肌細胞損傷過程尚未可知。本研究通過LPS誘導心肌細胞構建細胞損傷模型，觀察細胞中MFI2-AS1與miR-331-3p的表達水平，分析其對細胞增殖及凋亡的影響，旨在為揭示心肌損傷的分子機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠心肌細胞H9c2購自美國ATCC細胞庫。杜氏改良培養基(DMEM)購自美國Gibco公司；胎牛血清(fatal bovine serun，FBS)購自上海玉博生物科技有限公司；LPS購自上海睿安生物科技有限公司；Trizol試劑與pcDNA3.1購自美國Invitrogen公司；Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司；反轉錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；MFI2-AS1小干擾RNA(si-MFI2-AS1)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-331-3p寡核苷酸模擬物(miR-331-3p mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；miR-331-3p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-331-3p)及陰性對照(anti-miR-NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)、RIPA裂解液與二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量檢測試劑盒購自美國Sigma公司；膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)細胞凋亡試劑盒購自北京博爾邁生物技術有限公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司；兔抗鼠活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)、細胞周期蛋白1(CyclinD1)抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、轉染及實驗分組:采用含有10% FBS與100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基培養H9c2細胞，置于37℃恒溫培養箱進行培養，待細胞生長至70%時進行傳代培養。取對數期H9c2細胞，使用含有10 μg/ml的LPS處理H9c2細胞24 h[8]，記作LPS組。將未進行處理的H9c2細胞作為NC組。取對數期H9c2細胞，將培養基更換為不含血清的培養基，分別將si-NC、si-MFI2-AS1、miR-NC、miR-331-3p mimics、si-MFI2-AS1與anti-miR-NC、si-MFI2-AS1與anti-miR-331-3p轉染至H9c2細胞，繼續培養48 h，隨后使用含有10 μg/ml的LPS處理H9c2細胞24 h，分別記作LPS+si-NC組、LPS+si-MFI2-AS1組、LPS+miR-NC組、LPS+miR-331-3p組、LPS+si-MFI2-AS1+anti-miR-NC組、LPS+si-MFI2-AS1+anti-miR-331-3p組。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測細胞中MFI2-AS1、miR-331-3p的表達水平:采用Trizol法提取各組心肌細胞中總RNA，應用紫外分光光度計測定RNA濃度。MFI2-AS1正向引物5’-TGAGACGACATCCCTTCCAG-3’，反向引物5’-GGCCCTGAAATGACTTGCTC-3’；miR-331-3p正向引物5’-GATCCCAGATCAAACCAGGC-3’，反向引物5’-GCATGTTCTCCAGATGTCCTTTA-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。按照反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄合成cDNA，qRT-PCR反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 1 μl，ddH2O補足體系至20 μl；反應條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環40次。MFI2-AS1以β-actin為內參，miR-331-3p以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算MFI2-AS1、miR-331-3p的相對表達量。

1.2.3 MTT檢測細胞存活率:收集各組中對數期的心肌細胞，并調整細胞密度(5×104個/ml)，接種于96孔板上(100 μl/孔)，于轉染48 h時向每孔中加入20 μl MTT，37℃恒溫培養箱內繼續培養4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，利用酶標儀檢測各孔在波長為490 nm處的相對吸光度值(OD)，計算細胞存活率(%)=(各實驗組OD值-空白對照組OD值)/(正常對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率:收集各組對數期心肌細胞，預冷PBS洗滌，加入5 μl Annexin V-FITC，混勻，加入5 μl PI，混勻，室溫避光孵育10 min，置于FACS Calibur流式細胞儀及應用Cellauest軟件檢測各組細胞凋亡率。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測MFI2-AS1的靶基因:starbase預測顯示MFI2-AS1與miR-331-3p存在靶向關系，將含有結合位點及突變位點分別插入熒光素酶報告基因載體構建野生型質粒WT-MFI2-AS1與突變型質粒MUT-MFI2-AS1，分別將WT-MFI2-AS1、MUT-MFI2-AS1與miR-NC、miR-331-3p mimics共轉染至H9c2細胞，分別記作miR-NC組(WT-MFI2-AS1)、miR-331-3p組(WT-MFI2-AS1)、miR-NC組(MUT-MFI2-AS1)、miR-331-3p組(MUT-MFI2-AS1)。各組繼續培養48 h，收集細胞，參照熒光素酶活性檢測試劑盒檢測各組細胞相對熒光素酶活性。同時分別將si-NC、si-MFI2-AS1、pcDNA-NC、pcDNA-MFI2-AS1轉染至H9c2細胞，qRT-PCR檢測各組細胞中miR-331-3p的相對表達量。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測Cleaved-caspase-3、CyclinD1蛋白表達:收集各組對數期H9c2細胞，加入200 μl RIPA，冰上裂解30 min，4℃條件下經1 000 r/min離心10 min，吸取上清液(總蛋白)。取30 μg 蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻，高溫煮沸15 min，蛋白變性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜、封閉，加入Cleaved-caspase-3(稀釋比1∶1 000)、CyclinD1(1∶1 000)、β-actin(稀釋比1∶2 000)一抗稀釋液，洗膜，加入二抗(1∶5 000)，ECL顯影，應用Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

2 結果

2.1 在心肌細胞H9c2中LncRNA MFI2-AS1和miR-331-3p表達情況 與NC組相比，LPS組心肌細胞中MFI2-AS1的表達水平顯著升高(P<0.05)，miR-331-3p的表達水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 在心肌細胞H9c2中LncRNA MFI2-AS1和miR-331-3p表達情況

2.2 低表達MFI2-AS1對LPS處理的H9c2的增殖和凋亡影響 與NC組相比，LPS組心肌細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，細胞存活率顯著降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)；與LPS+si-NC組相比，LPS+si-MFI2-AS1組心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，細胞存活率顯著升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 低表達MFI2-AS1對LPS處理的H9c2的增殖和凋亡影響

圖1 低表達MFI2-AS1對LPS處理的H9c2的增殖和凋亡影響;A 流式細胞儀檢測細胞凋亡；B Western Blot檢測CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達

2.3 高表達miR-331-3p對H9c2的增殖和凋亡的影響 與LPS+miR-NC組相比，LPS+miR-331-3p組心肌細胞存活率顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)。見圖2,表3。

表3 高表達miR-331-3p對H9c2的增殖和凋亡的影響

圖2 Western Blot檢測CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達

2.4 LncRNA MFI2-AS1靶向調控miR-331-3p的表達 starbase預測顯示miR-331-3p和MFI2-AS1存在結合位點。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，共轉染野生型質粒WT-MFI2-AS1的心肌細胞中，miR-331-3p組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)；共轉染突變型質粒MUT-MFI2-AS1的心肌細胞中，miR-331-3p組與miR-NC組熒光素酶活性相比差異無統計學意義(P>0.05)。qRT-PCR檢測結果顯示，與si-NC組相比si-MFI2-AS1組心肌細胞中miR-331-3p的表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與pcDNA-NC組相比，pcDNA-MFI2-AS1組心肌細胞中miR-331-3p的表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖3，表4、5。

圖3 通過starbase預測miR-331-3p和MFI2-AS1結合示意圖

表4 miR-NC或miR-331-3p與報告質粒共轉染H9c2細胞后雙熒光素酶活性檢測

表5 qRT-PCR檢測miR-331-3p的表達

2.5 低表達miR-331-3p可以部分逆轉MFI2-AS1低表達對H9c2增殖和凋亡的影響 與LPS+si-MFI2-AS1+anti-miR-NC組相比，LPS+si-MFI2-AS1+anti-miR-331-3p組心肌細胞存活率顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)。見圖4，表6。

圖4 Western Blot檢測CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達

表6 低表達miR-331-3p可以部分逆轉MFI2-AS1低表達對H9c2增殖和凋亡的影響

3 討論

LncRNA可通過調控下游miRNA的表達從而參與心肌細胞凋亡及心肌細胞損傷過程[9,10]。但仍有部分LncRNA在心肌細胞損傷過程中的調控機制尚未闡明。因而本研究積極探尋新型LncRNA并分析其如何調控miRNA而發揮作用。

MFI2-AS1在神經膠質瘤與腎細胞癌等腫瘤中異常表達并可參與腫瘤發生及發展過程[11,12]。但MFI2-AS1在心肌細胞損傷中的表達尚未可知。本研究通過LPS誘導心肌細胞，結果發現細胞中MFI2-AS1的表達水平明顯升高，提示MFI2-AS1表達量升高可能促進心肌損傷的發生。研究表明CyclinD1表達量升高可促進細胞周期由G1期進入S期，促進細胞增殖，若細胞接收凋亡信號時，細胞凋亡蛋白可激活caspase-3級聯反應從而促進Cleaved-caspase-3表達量升高最終誘導細胞凋亡[13,14]。本研究結果顯示LPS處理后可明顯降低心肌細胞存活率，促進細胞凋亡，CyclinD1表達量降低，Cleaved-caspase-3表達量升高。提示LPS可促進心肌細胞凋亡，抑制細胞增殖從而破壞細胞增殖/凋亡的平衡狀態最終造成心肌損傷。本研究進一步分析顯示抑制MFI2-AS1表達后心肌細胞凋亡率降低，細胞存活率升高，CyclinD1表達上調，Cleaved-caspase-3表達下調，提示抑制MFI2-AS1表達可促進LPS誘導的心肌細胞存活，抑制細胞凋亡。

miR-331-3p在多發性骨髓瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌等多種腫瘤中異常表達并可參與腫瘤細胞增殖及凋亡過程[15-17]。但miR-331-3p在心功能障礙發生過程中的表達及其作用機制尚未可知。本研究結果顯示LPS誘導的心肌細胞中miR-331-3p的表達水平明顯降低，進一步研究顯示miR-331-3p過表達可明顯促進心肌細胞存活，抑制細胞凋亡，并可促進CyclinD1表達，抑制Cleaved-caspase-3表達，提示miR-331-3p過表達可能通過上調CyclinD1表達及下調Cleaved-caspase-3表達從而減輕LPS誘導的心肌細胞損傷。同時本研究通過雙熒光素酶報告實驗與qRT-PCR實驗證實MFI2-AS1可靶向調控miR-331-3p的表達，進一步研究顯示抑制miR-331-3p表達可明顯減弱抑制MFI2-AS1表達對LPS誘導的心肌細胞凋亡的抑制作用，及其對細胞增殖的促進作用。提示抑制MFI2-AS1表達可能通過上調miR-331-3p表達從而保護心肌細胞免受損傷。

綜上所述，抑制MFI2-AS1表達對LPS誘導的心肌細胞具有保護作用，其作用機制與MFI2-AS1靶向調控miR-331-3p的表達有關，通過調控MFI2-AS1表達可增強心肌細胞增殖能力，改善心臟功能，可為闡明膿毒癥所致心功能障礙的分子機制奠定理論基礎。