miR-135b-5p對IL-1β誘導軟骨細胞損傷的影響及機制研究

趙曉東 王磊

骨關節炎是最常見的關節疾病，是引發疼痛和殘疾的主要原因[1]。骨關節炎的主要特征包括關節軟骨的進行性退變、軟骨下骨重建和關節炎癥，最終導致嚴重的關節疼痛和功能喪失[2,3]。目前的骨關節炎藥物部分有效，使骨關節炎患者的治療策略有限，只能緩解疼痛或最終進行關節置換[4]。軟骨細胞是關節軟骨中唯一的細胞，通過細胞凋亡和細胞因子的產生，在骨性關節炎的病理進展中起關鍵作用[5]。因此，減輕軟骨細胞凋亡和炎性反應是一種有效的骨關節炎治療手段。研究表明，微小RNA-135b-5p(microRNA-135b-5p，miR-135b-5p)在氧-葡萄糖剝奪和復氧(Oxygen-glucose deprivation and reoxygenation，OGD/R)處理的海馬神經元細胞中表達顯著降低，過表達miR-135b-5p可顯著抑制OGD/R誘導的海馬神經元細胞損傷和氧化應激[6]。MiR-135b在1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)誘導的SH-SY5Y細胞損傷中下調表達，過表達miR-135b可促進MPP+誘導的SH-SY5Y細胞增殖，抑制細胞凋亡和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(Inter leukin-1β，IL-1β)的產生[7]。血管生成素樣蛋白2(Angiopoietin-like 2，ANGPTL2)在骨關節炎軟骨和IL-1β刺激后的軟骨細胞中表達明顯上調，表達上調的ANGPTL2可以促進慢性炎癥介質IL-1β、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)的表達[8]。ANGPTL2在糖尿病腎病大鼠腎組織中表達量明顯升高，ANGPTL2可能通過下調Nephrin及Podocin表達參與足細胞損傷機制[9]。但miR-135b-5p在IL-1β誘導軟骨細胞損傷中的表達及其對IL-1β誘導軟骨細胞損傷的影響，且miR-135b-5p是否通過靶向調控ANGPTL2的表達影響IL-1β誘導軟骨細胞損傷目前還尚未可知。因此，本研究考察miR-135b-5p對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的作用，并結合ANGPTL2，旨在探索其潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 SD大鼠(4周齡清潔級級，雌雄不限)購自上海斯萊克實驗動物公司，IL-1β購自美國Sigma公司，DMEM培養基(Dulbecco，s modified eagle medium)、青霉素-鏈霉素雙抗混合液購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國GIBCO公司，miR-NC、miR-135b-5p、anti-miR-NC、anti-miR-135b-5p、pcDNA、pcDNA-ANGPTL2購自武漢淼靈生物科技有限公司，逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)試劑盒購自美國應用生物系統公司，IL-6、TNF-α、γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)酶聯免疫(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)試劑盒、異硫氰酸熒光素標記的膜聯素Ⅴ(Annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate，Annexin Ⅴ-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司，ANGPTL2購自中國Proteintech公司，B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶標記二抗購自美國Cellular Signaling Technology公司。

1.2 細胞分離、培養 SD大鼠膝關節軟骨細胞的分離參照吳子健[10]的方法進行操作。將分離到的軟骨細胞置于含10%胎牛血清、100 U/ml青-鏈霉素的DMEM培養基中培養，并于37℃、5% CO2的培養箱中孵育。

1.3 細胞轉染與處理 選取第二代生長狀態良好的軟骨細胞，以適當密度接種于6孔板，根據Lipofectamine 2000試劑說明書的步驟，將miR-NC、miR-135b-5p、anti-miR-NC、anti-miR-135b-5p、pcDNA、pcDNA-ANGPTL2轉染到軟骨細胞。根據不同的實驗目的，使用10 ng/ml IL-1β處理軟骨細胞48 h[11]，記為IL-1β組，同時以未經任何處理的軟骨細胞設為對照(Con組)。并使用10 ng/ml IL-1β處理轉染后的軟骨細胞48 h。處理結束后，收集細胞用于各項指標檢測。

1.4 qPCR檢測miR-135b-5p和ANGPTL2 mRNA表達 在軟骨細胞中加入TRIzol試劑提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒的說明合成cDNA，以制成的cDNA為模板，進行qPCR反應。miR-135b-5p上游引物序列為：5’-GGTATGGCTTTTCATTCCT-3’，下游引物序列為：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。內參U6上游引物序列為：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物序列為：5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。ANGPTL2上游引物序列為：5’-GCCATCTGCGTCAACTCCAAGG-3’，下游引物序列為：5’-CTCACAATGCCGCCGTCCAC-3’。內參GAPDH上游引物序列為：5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，下游引物序列為：5’-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3’。根據2-ΔΔCt法進行miR-135b-5p和ANGPTL2的量化。

1.5 ELISA法檢測IL-6、TNF-α、IFN-γ水平 收集各組軟骨細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書的步驟，檢測IL-6、TNF-α、IFN-γ水平。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集5×104個軟骨細胞，離心后棄去上清液，加入195 μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，加入10 μl碘化丙啶(Propidium iodide，PI)染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，上流式細胞儀檢測軟骨細胞凋亡。

1.7 Western blot檢測ANGPTL2、Bcl-2、Bax蛋白表達 以RIPA裂解液從軟骨細胞中提取總蛋白，20 μg蛋白經過12% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉移到聚偏二氟乙烯膜，轉膜完成后用5%脫脂牛奶封閉1 h，與ANGPTL2、Bcl-2、Bax蛋白一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，與辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，增強化學發光液顯色，GAPDH為內參照，計算ANGPTL2、Bcl-2、Bax蛋白表達。

1.8 雙熒光素酶報告實驗 Targetscan(http://www.targetscan.org/)預測發現，miR-135b-5p與ANGPTL2 3’非編碼區(3’untranslated region,3’UTR)部分堿基可形成互補配對。為證實miR-135b-5p與ANGPTL2是否存在靶向關系，分別構建包含miR-135b-5p結合位點的野生型ANGPTL2(WT-ANGPTL2)和突變型ANGPTL2(MUT-ANGPTL2)3’UTR熒光素酶報告基因質粒，利用Lipofectamine 2000試劑將miR-NC、miR-135b-5p與WT-ANGPTL2或MUT-ANGPTL2共轉染，使用雙熒光素酶報告系統測定轉染48 h后的熒光素酶活性。

2 結果

2.1 miR-135b-5p和ANGPTL2在IL-1β誘導軟骨細胞損傷中的表達 qPCR和Western blot檢測結果顯示，與Con組比較，IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-135b-5p表達量明顯減少，ANGPTL2 mRNA和ANGPTL2蛋白表達量顯著增加(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 ANGPTL2蛋白表達

表1 miR-135b-5p和ANGPTL2在IL-1β誘導軟骨細胞損傷中的表達

2.2 miR-135b-5p過表達對IL-1β誘導軟骨細胞炎癥因子表達的影響 qPCR檢測數據表明，與Con組比較，IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-135b-5p表達量明顯減少；與IL-1β+miR-NC組比較，IL-1β+miR-135b-5p組軟骨細胞中miR-135b-5p表達量顯著增加(P<0.05)。ELISA檢測結果發現，與Con組比較，IL-1β誘導的軟骨細胞內IL-6、TNF-α、IFN-γ水平明顯升高；與IL-1β+miR-NC組比較，IL-1β+miR-135b-5p組軟骨細胞的IL-6、TNF-α、IFN-γ水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 miR-135b-5p過表達對IL-1β誘導軟骨細胞炎癥因子表達的影響

2.3 miR-135b-5p過表達對IL-1β誘導軟骨細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果發現，與Con組比較，IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡率大幅增加；與IL-1β+miR-NC組比較，IL-1β+miR-135b-5p組軟骨細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。Western blot檢測結果顯示，與Con組比較，IL-1β誘導的軟骨細胞Bcl-2蛋白表達量明顯減少，Bax蛋白水平顯著提高；與IL-1β+miR-NC組比較，IL-1β+miR-135b-5p組軟骨細胞Bcl-2蛋白表達量明顯增加，Bax蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見表3，圖2。

圖2 miR-135b-5p過表達對IL-1β誘導軟骨細胞凋亡的影響

表3 miR-135b-5p過表達對IL-1β誘導軟骨細胞凋亡的影響

2.4 miR-135b-5p靶向調控ANGPTL2的表達 Targetscan預測發現，ANGPTL2的3’UTR中含有與miR-135b-5p互補的核苷酸序列。雙熒光素酶報告實驗結果表明，與miR-NC和WT-ANGPTL2共轉染比較，miR-135b-5p和WT-ANGPTL2共轉染明顯降低熒光素酶活性(P<0.05)，與miR-NC和MUT-ANGPTL2共轉染比較，miR-135b-5p和MUT-ANGPTL2共轉染的熒光素酶活性無明顯變化。與miR-NC組比較，miR-135b-5p明顯減少ANGPTL2蛋白表達量，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-135b-5p顯著提高ANGPTL2蛋白水平(P<0.05)。見圖3，表4、5。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖3 miR-135b-5p靶向調控ANGPTL2的表達；A ANGPTL2的3’UTR中含有與miR-135b-5p互補的核苷酸序列；B ANGPTL2蛋白表達

表5 miR-135b-5p調控ANGPTL2蛋白的表達

2.5 ANGPTL2過表達逆轉了miR-135b-5p過表達對IL-1β誘導軟骨細胞損傷的影響 與IL-1β+miR-NC組比較，IL-1β+miR-135b-5p組軟骨細胞ANGPTL2蛋白表達量、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平、凋亡率、Bax蛋白表達量明顯降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)。與IL-1β+miR-135b-5p+pcDNA組比較，IL-1β+miR-135b-5p+pcDNA-ANGPTL2組軟骨細胞中ANGPTL2蛋白、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平、凋亡率、Bax蛋白水平明顯提高，Bcl-2蛋白表達量顯著減少(P<0.05)。見圖4,表6。

圖4 ANGPTL2過表達逆轉了miR-135b-5p過表達對IL-1β誘導軟骨細胞凋亡的影響；A ANGPTL2和凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表6 ANGPTL2過表達逆轉了miR-135b-5p過表達對IL-1β誘導軟骨細胞損傷的影響

3 討論

骨關節炎是一種嚴重影響老年人健康的退行性關節疾病，主要臨床表現為關節反復疼痛和關節運動障礙逐漸加重，嚴重危害中老年人群的身體健康，影響患者的生活質量，給個人、家庭甚至社會帶來沉重的負擔[12]。臨床上，骨關節炎的主要治療方法是緩解關節疼痛，維持或改善關節的生理功能，保護關節的組織結構。然而，目前的效果并不令人滿意。為了識別減輕癥狀和預防殘疾的新治療靶標，需要進一步研究以了解骨關節炎的發病機理。

軟骨內穩態對于關節功能至關重要，在骨關節炎進展中，軟骨內穩態會趨向于破壞[13]。軟骨細胞通過調節軟骨基質合成與降解的平衡，被證實是維持軟骨完整性的關鍵參與者。炎性細胞因子通常導致細胞功能障礙，尤其是在軟骨細胞中。軟骨細胞可通過分泌炎性因子來促進軟骨降解。炎癥因子可以多種方式刺激級聯反應，不斷刺激軟骨細胞分泌細胞因子，進而觸發骨關節炎[14]。IL-1β是一關鍵的促炎因子，是骨關節炎的介質之一[15]。既往研究表明，IL-1β刺激關節正常的軟骨細胞可模擬骨關節炎軟骨細胞[16]。本研究同樣利用IL-1β復制骨關節炎軟骨細胞損傷模型，發現IL-1β會促進軟骨細胞凋亡和炎性反應，引起軟骨細胞損傷。miR-135b-5p可以保護IL-1β誘導的軟骨細胞損傷，為骨關節炎的防治提供了一個有吸引力的靶點。

微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是一類內源性的小非編碼RNA，長度為18～22個核苷酸。miRNA的主要作用是通過翻譯抑制和(或)靶mRNA降解來調控靶基因。miRNA負調節基因表達，并且已顯示在隨著年齡增長的軟骨細胞發育和軟骨穩態中都起著關鍵作用，許多miRNA通過信號傳導途徑，凋亡，自噬和衰老在軟骨細胞表型中發揮作用[17]，可作為骨關節炎有前景的生物標志物。miR-135b-5p是其中一種miRNA，除了參與胰腺癌[18]、乳腺癌[19]、卵巢癌[20]、胃癌[21]等癌癥進展，還可以保護神經細胞損傷[6]。miR-135b-5p可抑制脂多糖(Lipopolysaccharid，LPS)誘導的巨噬細胞中TNF-α和ROS的產生[22]。但miR-135b-5p在骨關節炎中的生物學功能尚未可知。本研究中，miR-135b-5p表達在IL-1β誘導的軟骨細胞中明顯下調，miR-135b-5p過表達明顯降低IL-1β誘導的軟骨細胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平、凋亡率、Bax蛋白表達量，顯著提高Bcl-2蛋白水平，說明miR-135b-5p對IL-1β誘導軟骨細胞損傷具有保護作用，能夠減輕細胞凋亡和炎性反應，與前人研究[6,22]相符。

研究表明，某些miRNA可以直接靶向與骨關節炎的發病機制和發育有關的不同基因，并且在調節軟骨細胞的活性和功能中起著至關重要的作用，如miR-20靶向IκBβ影響LPS誘導的軟骨細胞促炎細胞因子的產生和細胞凋亡[23]，miR-34a靶向調控TGIF2誘導骨關節炎滑膜細胞凋亡[24]，miR-33b-3p靶向DNA甲基轉移酶3(DNA methyltransferase 3A，DNMT3A)促進IL-1β誘導的軟骨細胞增殖，抑制軟骨細胞凋亡和軟骨細胞外基質降解[25]。因此，明確骨關節炎所涉及的miRNA調控網絡，了解其作用機制，有助于為骨關節炎的防治提供新的治療策略。本實驗中，IL-1β誘導的軟骨細胞中ANGPTL2 mRNA、ANGPTL2蛋白表達顯著升高，提示ANGPTL2參與IL-1β誘導的軟骨細胞損傷過程。為了進一步探索miR-135b-5p保護IL-1β誘導軟骨細胞損傷的作用機制，利用生物信息學預測miR-135b-5p的靶基因，發現miR-135b-5p與ANGPTL2的3’UTR具有靶向結合位點。雙熒光酶素實驗證實miR-135b-5p靶向調控ANGPTL2的表達。并且，上調miR-135b-5p的表達顯著抑制ANGPTL2表達，下調時則相反。ANGPTL2過表達逆轉了miR-135b-5p過表達對IL-1β損傷的軟骨細胞凋亡、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平、Bax蛋白表達的抑制作用，和對Bcl-2蛋白表達的促進作用。這些結果表明，靶向調控ANGPTL2表達可能是miR-135b-5p保護IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的重要途徑之一。

綜上所述，miR-135b-5p在IL-1β誘導的軟骨細胞中表達下調，其過表達明顯抑制IL-1β損傷的軟骨細胞凋亡和炎性反應，發揮保護作用，其作用機制與靶向調控ANGPTL2表達有關，這為骨關節炎的預防和干預提供了新的線索。