基于Wnt通路分析沉默miR-720對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

熊志偉 劉少波 謝志敏 谷萬春 李燕

腦膠質(zhì)瘤是一種臨床較為常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，主要由機(jī)體腦組織膠質(zhì)細(xì)胞癌變發(fā)生的，主要臨床表現(xiàn)為頭痛、視力下降、嘔吐、精神癥狀等，對(duì)患者身體健康、生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響[1-3]。近年來，我國腦膠質(zhì)瘤癥狀發(fā)病率一直居高不下，引起廣大專家學(xué)者的關(guān)注，相比其他惡性腫瘤，腦膠質(zhì)瘤具有惡性程度高、治療難度大、治療后復(fù)發(fā)率高、病死率高等特點(diǎn)，因此大多數(shù)專家學(xué)者開始致力于腦膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制、臨床治療的研究[4,5]。本文研究中設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，靶向調(diào)控腦膠質(zhì)瘤miR-720表達(dá)，并對(duì)Wnt通路蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，旨在探究miR-720靶向調(diào)控Wnt通路對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 研究細(xì)胞：腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院)。主要試劑：兔抗大鼠miR-720抗體(Sigma公司)；兔抗小鼠P53抗體(Hyclone公司)；兔抗小鼠caspase3抗體(Invitrogen公司)；大鼠抗小鼠Bcl-2抗體(BD公司)；小鼠抗大鼠Bax抗體(Gibco公司)；小鼠抗兔Wnt3a、β-catenin抗體(Selleck公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):在40℃的環(huán)境中對(duì)凍存的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行火浴處理，之后進(jìn)行充分搖晃，將搖晃均勻的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞置于2 ml的培養(yǎng)基[10%PBS、1%雙抗(青鏈霉素)RPMI-1640培養(yǎng)基500 ml]之內(nèi)，之后使用2 000 r/min的離心機(jī)進(jìn)行離心處理，進(jìn)行重懸處理后將細(xì)胞傳代，使用CO2培養(yǎng)箱對(duì)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h、換液，細(xì)胞融合率達(dá)90%后傳代。

1.2.2 慢病毒載體構(gòu)建及分組:miR-720基因序列根據(jù)質(zhì)粒特點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引入SacⅠ酶切位點(diǎn)，miR-720正向引物序列：5’UCUCGCUGGGGCCUCCA3’。miR-720反向引物序列：5’GAGGCCCCAGCGAGAUU3’。正反鏈混合后加入退火緩沖液，96℃反應(yīng)4 min，室溫冷卻，生成雙鏈。使用Eco31Ⅰ酶切線性化質(zhì)粒pGenesil-1，100倍稀釋退火產(chǎn)物之后與其連接，20℃下水浴孵育過夜，使用大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化，第2天選擇單克隆菌落，在30 μg/ml Kana的LB培養(yǎng)液中接種，2 000 r/min離心處理，37℃下震混，孵育過夜。少量抽提質(zhì)粒后使用SacⅠ酶切進(jìn)行鑒定，分為空白組、過表達(dá)miR-720組和沉默miR-720組,重懸處理后分別加入4 μg 0.9%氯化鈉溶液、pcDNA3.1-miR-720、miR-720siRNA，電擊處理后室溫環(huán)境下存放120 min，將各組細(xì)胞加入6孔、96孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),后加入含800 μg/ml G418的培養(yǎng)基再次培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè):MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力。將各組細(xì)胞加入96孔板中，分別于24、48、72 h后再每孔中加入30 μl的MTT液，37℃孵育4 h，棄培養(yǎng)液，加入150 μl的DMSO，酶標(biāo)儀在498波長處檢測(cè)每孔的OD值。

1.2.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況:常溫環(huán)境中使用20 μg/ml蛋白酶K培養(yǎng)0.5 h后去除蛋白，使用PBS緩沖液進(jìn)行徹底清洗，之后將平衡緩沖液100 μl加入其中，室溫環(huán)境中平衡10 min，之后滴入TdT酶反應(yīng)液100 μl，避光、室溫環(huán)境中孵育1 h，之后加入100 μl SSC溶液，常溫環(huán)境中靜置20 min后進(jìn)行清洗3次，之后使用DAPI進(jìn)行復(fù)染，避光培養(yǎng)10 min后再次進(jìn)行浸洗，封片觀察。DAPI復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色，取每切片3視野進(jìn)行觀察、計(jì)算細(xì)胞凋亡率，計(jì)算平均值。

1.2.5 細(xì)胞侵襲、遷移情況:使用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲。2 h前濕化小室。上室加入細(xì)胞懸液200 μl，在下室加入含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用PBS沖洗2次后置于4%多聚甲醛中30 min。染色后放在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。使用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移。將細(xì)胞使用胰酶消化制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板。使用10槍尖垂直于孔板底部畫直線，PBS緩沖液清洗3次。常溫培養(yǎng)24 h拍照計(jì)算劃痕。

1.2.6 miR-720表達(dá)檢測(cè):RT-PCR檢測(cè)miR-720表達(dá)。提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA純度、含量，逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，采用2-△△Ct方法計(jì)算miR-720表達(dá)量。

A B C

1.2.7 P53、caspase3、Bcl-2、Bax、Wnt3a、β-catenin相對(duì)表達(dá)量檢測(cè):蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)P53、caspase3、Bcl-2、Bax、Wnt3a、β-catenin表達(dá)：取150℃ Ripa裂解液,1.5℃ PMSF冰中孵育30 min,1 500 r/min離心15 min，取上清。每個(gè)樣品取15 g蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)入PDVF膜，5%脫脂牛奶常溫下密封2 h。加入抗體過夜。取出后使用TBST液沖洗，結(jié)合二抗，60 min后清洗、顯色，對(duì)P53、caspase3、Bcl-2、Bax、Wnt3a、β-catenin相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞miR-720、P53相對(duì)表達(dá)量比較 與空白組相比，過表達(dá)miR-720組細(xì)胞miR-720、P53相對(duì)表達(dá)量較高，沉默miR-720組細(xì)胞miR-720、P53相對(duì)表達(dá)量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與過表達(dá)miR-720組相比，沉默miR-720組細(xì)胞miR-720、P53相對(duì)表達(dá)量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組細(xì)胞miR-720、P53相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 3組細(xì)胞增殖率、凋亡率比較 24 h、48 h、72 h時(shí)，與空白組相比，過表達(dá)miR-720組細(xì)胞增殖率較高，凋亡率較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；24 h、48 h、72 h時(shí)，與空白組、過表達(dá)miR-720組相比，沉默miR-720組細(xì)胞增殖率較低，凋亡率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組細(xì)胞增殖率、凋亡率比較

2.3 3組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較 與空白組相比，過表達(dá)miR-720組侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)較高，沉默miR-720組侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)較低(P<0.05)；與過表達(dá)miR-720組相比，沉默miR-720組侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)較低(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 3組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較 個(gè),

空白組 過表達(dá)miR-720組 沉默miR-720組

2.4 3組細(xì)胞caspase3、Bcl-2、Bax相對(duì)表達(dá)量比較 與空白組相比，過表達(dá)miR-720組細(xì)胞Bcl-2相對(duì)表達(dá)量較低，caspase3、Bax相對(duì)表達(dá)量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與空白組、過表達(dá)miR-720組相比，沉默miR-720組細(xì)胞Bcl-2相對(duì)表達(dá)量較高，caspase3、Bax相對(duì)表達(dá)量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4，圖2。

表4 3組細(xì)胞caspase3、Bcl-2、Bax相對(duì)表達(dá)量比較

ABC

2.5 3組細(xì)胞Wnt3a、β-catenin相對(duì)表達(dá)量比較 與空白組相比，過表達(dá)miR-720組細(xì)胞Wnt3a、β-catenin相對(duì)表達(dá)量較高，沉默miR-720組細(xì)胞Wnt3a、β-catenin相對(duì)表達(dá)量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與過表達(dá)miR-720組相比，沉默miR-720組細(xì)胞Wnt3a、β-catenin相對(duì)表達(dá)量較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5，圖3。

表5 3組細(xì)胞Wnt3a、β-catenin相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

腦膠質(zhì)瘤具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、病死率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅患者生命安全[6,7]。但是目前為止臨床醫(yī)學(xué)尚未將腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制研究透徹，許多專家學(xué)者通過分子生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等途徑致力與腦膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制的研究[8,9]。微小RNA(miRNA)在大多數(shù)生物中大量存在，miRNA與機(jī)體組織細(xì)胞分化、凋亡等生物學(xué)行為具有密切聯(lián)系。miRNA同時(shí)具有組織特異性、穩(wěn)定性、保守性等特點(diǎn)，腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展與miRNA之間具有密切聯(lián)系，在癌組織發(fā)展過程中，miRNA具有抑癌、促癌的特性，是臨床常用的診斷腫瘤的標(biāo)志物[10-12]。有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)，miR-720在腦膠質(zhì)瘤中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，但是關(guān)于靶向調(diào)控miR-720表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者病情嚴(yán)重程度、預(yù)后影響的研究還鮮有報(bào)道[13]。

P53是一種廣譜的抑癌基因，在細(xì)胞凋亡、DNA結(jié)合、修復(fù)等過程中發(fā)揮重要作用[14]。邢海霞等[15]在研究中表示，P53在腦膠質(zhì)瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)，與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系。本文研究結(jié)果顯示，沉默腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-720表達(dá)，P53表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)，出現(xiàn)這一研究結(jié)果的原因可能是沉默miR-720表達(dá)能夠靶向調(diào)控P53表達(dá)，從而對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的不斷發(fā)展產(chǎn)生抑制作用。

癌組織的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖、凋亡能力的變化具有密切聯(lián)系[16]。有學(xué)者在研究中表示，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖率較高、凋亡率較低，抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡是臨床治療腦膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵[17]。本文研究結(jié)果顯示，沉默腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-720表達(dá)，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖率出現(xiàn)明顯下降，凋亡率出現(xiàn)明顯上升，說明沉默miR-720表達(dá)能夠有效抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，從而起到抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞不斷發(fā)展的作用。

除增殖、凋亡外，癌細(xì)胞的發(fā)展情況還與細(xì)胞侵襲、遷移能力變化密切相關(guān)。謝小娟等[18]在研究中表示，抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力，是抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞不斷發(fā)展、擴(kuò)散的關(guān)鍵。本文研究結(jié)果顯示，沉默腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-720表達(dá)，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)下降，說明沉默miR-720表達(dá)能夠有效抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力，從而對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的不斷發(fā)展擴(kuò)散起到抑制作用。

癌細(xì)胞增殖、凋亡能力的變化與細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的變化具有密切聯(lián)系。caspase3作為caspase家族重要成員，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[19]。Bcl-2、Bax是線粒體細(xì)胞凋亡通路中的重要基因，二者表達(dá)的變化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[20,21]。本文研究結(jié)果顯示，沉默腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-720表達(dá)，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞caspase3、Bax表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，說明沉默miR-720表達(dá)能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡蛋白caspase3、Bcl-2、Bax的表達(dá)，從而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)這一研究的原因可能是沉默miR-720表達(dá)能夠靶向調(diào)控Wnt信號(hào)通路，對(duì)caspase3、Bcl-2、Bax表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡、增殖能力。

有學(xué)者在研究中表示，Wnt信號(hào)通路與腫瘤組織細(xì)胞的分化、生長、凋亡具有密切聯(lián)系，該通路蛋白的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移密切相關(guān)[22,23]。Wnt3a為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的主要配體，Wnt3a、β-catenin表達(dá)的變化在細(xì)胞自噬、凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用。本文研究結(jié)果顯示，沉默腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-720表達(dá)，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞Wnt3a、β-catenin表達(dá)明顯下調(diào)說明沉默miR-720表達(dá)能夠靶向調(diào)控Wnt信號(hào)通路，影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬、凋亡能力，從而對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的不斷發(fā)展、擴(kuò)散產(chǎn)生抑制作用。

綜上所述，沉默腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-720表達(dá)，能夠靶向調(diào)控P53表達(dá)，抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，可能是因?yàn)槌聊X膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-720表達(dá)能夠靶向調(diào)控Wnt通路，對(duì)caspase3、Bcl-2、Bax表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而起到抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用。