脂氧素A4抑制TLR4/NOX4/NF-κB通路減輕膿毒癥大鼠腦損傷的研究

朱國輝 魏鋒

膿毒癥是導致危重患者死亡的重要原因，在臨床上表現為感染和應激條件下的多系統并發癥，其中包括腦損傷[1]。此外，膿毒癥還與多種流行病學因素導致的多種免疫相關信號通路異常激活有關[2]。盡管目前對于膿毒癥的研究進展迅速，但膿毒癥的發病率仍然居高不下[3,4]。研究表明，機體的免疫功能紊亂是膿毒癥的重要病理生理機制，包括了過度炎性反應和免疫抑制兩個方面[5]。促炎細胞因子在先天免疫反應中的作用是膿毒癥病理生理學領域中研究最廣泛的方面之一。惡化的外周炎癥可導致神經炎癥，進而導致中樞神經系統的嚴重損傷。隨后與膿毒癥相關的血腦屏障破壞促進了神經膠質細胞的活化，并在中樞神經系統中引發一場促炎細胞因子風暴，導致膿毒癥幸存者的腦功能障礙[6]。膿毒癥的許多幸存者遭受長期認知障礙，經歷過嚴重膿毒癥住院治療的患者出現中度至重度大腦皮層損傷的可能性是正常人的2倍多[7]。 這些慢性神經功能障礙導致致命的不良后果，然而盡管投入了大量的時間和精力，與腦損傷相關的神經系統疾病的治療仍然缺乏成功的干預措施。Toll樣受體4(TLR4)是參與信號轉導的重要跨膜蛋白，可以充當微生物傳感器來觸發炎癥和免疫反應，當其與配體結合時，TLR4可誘導下游多種信號途徑[8]。NADPH氧化酶4(NOX4)是內源性ROS產生的主要來源，越來越多的研究表明TLR4和NOX4的結合對于ROS的產生至關重要[9]。NF-κB是一種廣泛分布的轉錄因子，可以控制許多生物過程，包括炎性反應和細胞凋亡，在神經炎癥中發揮重要作用[10]。脂氧素A4(LXA4)是花生四烯酸的生物活性產物，已被證明具有很強的抗炎活性。有研究證明LXA4能降低膿毒癥大鼠血清白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α水平，減輕炎性反應，該作用可能通過抑制TLR4信號通路實現[11]。本研究探討脂氧素A4膿毒癥大鼠腦組織損傷中的作用，以及該保護作用與TLR4/NOX4/NF-κB通路之間的關系。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立和樣品的采集與處理 清潔級SD大鼠(購自天津醫科大學，動物合格證號：110322210100605613)32只，體重約280 g，12周齡，術前禁食12 h。經腹腔注射5%戊巴比妥1 mg/kg麻醉。對腹部進行常規消毒，并做一個約2 cm的切口。在腹腔中發現盲腸后，將遠端盲腸和大腸之間的腸系膜分離并將盲腸遠端結扎1/2，用針在中間穿刺，然后將盲腸放回腹腔，縫合腹部。正常對照組(S組)，不做結扎和穿刺外，其余步驟皆相同。脂氧素A4組(LXA4組)和TLR4激動劑組(Pam組)按照該步驟建造盲腸結扎穿孔模型后，都進行脂氧素A4 50 μg/kg腹腔注射，Pam組同時給予2 mg/kg的Pam3Cys腹腔注射。模型完成12 h，經腹腔注射5%戊巴比妥1 mg/kg麻醉大鼠，從下腔靜脈收集血液并離心，收集血清并儲存在-80℃用于檢測血清生化指標。取腦組織，分別放在甲醛固定溶液中用于隨后的蘇木精-伊紅(HE)染色試驗(中國武漢博斯特)，剩余的儲存在-80℃用于測量mRNA、酶活性和蛋白質表達水平。

1.2 HE染色法觀察4組腦組織的病理變化 取出固定在組織固定溶液中的腦組織，用自動包埋機包埋石蠟進行石蠟切片，厚度為5 mm。接下來，將切片脫蠟和梯度脫水，最后干燥的薄片用蘇木精染色20 min，用鹽酸和乙醇溶液分離30 s，用曙紅染色12 min，用90%乙醇分離45 s，封片晾干后在光學顯微鏡下觀察。

1.3 酶聯免疫吸附法測定炎性因子含量 血清炎性因子是腦損傷的重要指標，能夠指示損傷修復的程度。酶聯免疫吸附試驗試劑盒和所有試劑在室溫下緩沖30 min，制備標準溶液，然后孵育，加入生物素標記的抗體，孵育，洗滌。隨后，根據實際情況的說明，檢測所有指標的變化。最后，使用微孔板讀數器讀取各組炎癥因子的吸光度從分算出炎性因子的含量。

1.4 腦組織髓過氧化物酶(MPO)活性的檢測 為了觀察中性粒細胞在腦部的浸潤情況而進行MPO的活性測定。將儲存在-80℃的腦組織小心地取出并放在冰上。然后，將組織加入裂解溶液并進行低溫均質化，隨后離心。接下來，收集上清液，用分光光度法測定大腦勻漿中的MPO活性。結果以mg表示。

1.5 各組大鼠的神經功能評分和腦組織含水量檢測 在每組處死大鼠之前，根據Longa 5分評分法對神經功能進行評分,評分為6個等級：0分：正常，無神經功能缺損；1分：左側前爪不能完全伸展，輕度神經功能缺損；2分：行走時，大 鼠向左側(癱瘓側)轉圈，中度神經功能缺損；3分：行走時，大鼠身體向左側(癱瘓側)傾倒。重度神經功能缺損；4分：不能自發行走，有意識喪失；5分：死亡。將得分最高和最低的大鼠丟棄。在實驗過程中，具有其他臨床癥狀的大鼠也被丟棄，并且以隨機方式對大鼠進行強化。采用干濕重法檢測腦組織含水量。

1.6 qRT-PCR 檢測TLR4/NOX4/NF-κB通路相關基因表達 從每組大鼠中提取腦組織勻漿，并使用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)試劑盒提取總RNA。用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測核糖核酸的濃度、純度和完整性，在符合檢測標準后，根據操作說明反轉錄為cDNA。GAPDH引物：上游5’-GGTGGTCATATGACAAAACTTGAAGAG-3’，下游5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’;TLR4引物：上游 5’-CTGAACCAGGGCATACCTGT-3’，下游5’-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3’；NOX4引物：上游 5’-TGCATGGTGGTGGTATTGTTCCTC-3’，下游5’-AGCAGCAGCAGCATGTAGAAGAC-3’；NF-κB引物：上游 5’-CTGAACCAGGGCATACCTGT-3’，下游 5’-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3’。按說明書的方法步驟配制反應體系，經過94℃預變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，擴增45個循環。結果使用比較閾值法定量分析，計算方法為：目的基因定量拷貝數=2-ΔΔCt，ΔCt=目的基因 Ct 值-內參基因 Ct 值，ΔΔCt=ΔCt 實驗組-ΔCt 對照組，對每一標本計算目的基因的拷貝數

1.7 蛋白印跡實驗檢測 稱重冷凍腦組織樣品并在冰上研磨。加入RAPA裂解液制成勻漿，在冰上裂解30 min，每10分鐘震蕩1次，直到組織完全溶解以釋放組織蛋白。此后，將混合物離心，收集上清液。根據雙喹啉酸(BCA)試劑盒的說明進行蛋白質濃度的測定的，然后計算每種蛋白質的濃度。最后加入5×上樣緩沖液于100℃下變性10 min。配置12%分離膠進行蛋白質分離，并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。此后，在室溫下用5%脫脂乳封閉膜1.5 h，加一抗GAPDH、TLR4、NOX4、NF-κB(1∶1 000稀釋)在4℃下孵育過夜，TBST清洗后，加入HRP標記的羊抗兔二抗(1∶2 500)室溫孵育1 h，加入顯色液，凝膠成像系統用于顯影和成像。GAPDH用于校正待測蛋白質的水平。最后，分析各個蛋白質條帶的灰度值。該實驗獨立重復3次。

2 結果

2.1 4組大鼠腦組織病理的變化 S組神經細胞基本結構完整，邊界清晰，神經元形態正常，頂膜清晰，腦組織皮質核均勻清晰；CLP組和Pam組出現異常和紊亂的神經元結構，基本結構被破壞，出現空泡；LXA4組的病理損傷程度明顯減輕，基本結構相對完整，神經元形態相對正常。見圖1。

圖1 腦組織病理的變化 (黑色箭頭標記受損神經元，HE×200)

2.2 血清TNF-α、IL-1和IL-6水平與腦組織中的MPO活性比較 與S組相比，其余3組的TNF-α、IL-1和IL-6水平和MPO活性均有升高(P<0.05)；而和CLP組相比，LXA4組的TNF-α、IL-1和IL-6水平和MPO活性均明顯下降(P<0.05)；CLP組和Pam組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 血清TNF-α、IL-1和IL-6水平與腦組織中的MPO活性比較

2.3 4組大鼠神經功能評分和腦組織含水量比較 與S組相比，其余3組的腦功能評分和腦組織含水量均有所提高(P<0.05)；與CLP組相比，LXA4組的腦功能評分和腦組織含水量均明顯降低(P<0.05)；CLP組和Pam組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 大鼠神經功能評分和腦組織含水量比較

2.4 4組大鼠腦組織qRT-PCR 檢測相關基因表達結果 與S組相比，其余3組的TLR4mRNA、NOX4mRNA和NF-κB mRNA 的表達水平明顯上升(P<0.05)；與CLP組相比，LXA4組的TLR4mRNA、NOX4mRNA和NF-κB mRNA的表達水平明顯下降(P<0.05)；CLP組和Pam組差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 4組大鼠腦組織qRT-PCR 檢測相關基因表達結果

2.5 信號通路蛋白的檢測結果 與 S組相比，其余3組的TLR4、NOX4和NF-κB的表達水平顯著上調(P<0.05)；與CLP組相比，LXA4組的TLR4、NOX4和NF-κB的表達水平顯著下調(P<0.05)；CLP組和Pam組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2，表4。

圖2 4組大鼠腦組織TLR4、NOX4和NF-κB的表達量

表4 4組大鼠腦組織TLR4、NOX4和NF-κB的表達量

3 討論

隨著膿毒癥研究的深入，膿毒癥的進展逐漸變得清晰。膿毒癥的臨床病理過程主要包括細胞因子風暴、炎癥介質增加、腸道細菌移位、內毒素血癥以及凝血系統與炎癥的相互作用[12-14]。膿毒癥通常伴隨著組織和器官的損傷，這是高死亡率的原因之一[15]。膿毒癥會導致腦損傷，從而導致慢性神經功能障礙(包括大腦和認知麻痹以及其他缺陷)，對患者的預后造成嚴重影響[16]。然而，關于腦損傷相關神經疾病的治療，仍然缺乏成功的干預措施。因此，迫切需要新的治療方法，為膿毒癥及其并發癥的防治提供依據。本研究建立膿毒癥大鼠模型，研究脂氧素A4的治療作用及其具體作用機制。

脂氧素A4(LXA4)，是一種由花生四烯酸產生的內源性脂氧合酶衍生的類花生酸介體，它對各種細胞類型具有強大的雙重抗炎和促分解作用。在膿毒癥大鼠模型中，LXA4能降低血清IL-6和TNF-α水平，減輕炎性反應，并且能抑制膿毒癥大鼠肝臟中TLR4和TRAF6的表達，表明LXA4的抗炎作用可能通過抑制TLR4信號通路實現[17]。多項研究表明LXA4 可抑制白細胞介導的損傷，促進單核細胞的趨化性和吞噬作用并且抑制促炎細胞因子的產生和細胞增殖，已被多個動物實驗模型證明具有治療潛力[18-20]。本實驗結果顯示，膿毒癥組大鼠血清中TNF-α、IL-1和IL-6水平與腦組織中的MPO活性均明顯上升，而給予LXA4干預治療后，血清中TNF-α、IL-1和IL-6水平與腦組織中的MPO活性均明顯下降，表明炎性反應有所減輕。由于腦損傷時可能會出現慢性神經功能障礙，包括腦性癱瘓和認知及其他缺陷，我們對大鼠的神經功能進行了評分。結果顯示，膿毒癥組部分大鼠不能行走，全身向對側屈曲，同時伴隨著腦水腫，正常組大鼠無異常，LXA4干預治療組大鼠與對照組大鼠狀態相似，腦水腫程度也有所減輕。HE染色結果顯示，膿毒癥組大鼠腦組織神經元結構異常紊亂，基本結構被破壞，LXA4干預治療組腦組織基本結構完整，邊界清晰，神經元形態正常，細胞質清晰，皮質核均勻清晰。然而，LXA4治療的基礎上同時給予TLR4激動劑劑Pam3Cys干預，結果發現，LXA4的治療效果被中和，表明LXA4的治療作用可能與抑制TLR4及其下游通路有關。

TLR4的激活及其下游信號通路在膿毒癥致腦損傷機制中發揮了重要作用[21,22]。NOX4 是NADPH 氧化酶亞型的一種，在血腦屏障血管內皮細胞和神經元中特異性表達，在缺血或缺氧時被誘導，將氧轉化為活性氧，在小鼠心臟、大腦和后肢缺血模型中顯示，只有在大腦中NOX4才會導致缺血性損傷[23]。在脂多糖的刺激下，NOX4的COOH末端區域可以直接偶聯 TLR4并誘導 NF-κB激活。為了進一步分析TLR4及其下游信號通路的作用，我們用qRT-PCR 檢測了各組大鼠腦組織中TLR4mRNA、NOX4mRNA和NF-κB mRNA的表達量，Western blot 檢測了各組大鼠腦組織中TLR4，NOX4和NF-κB蛋白的表達量。結果發現，在膿毒癥組無論是TLR4mRNA、NOX4mRNA和NF-κB mRNA的表達量還是TLR4，NOX4和NF-κB蛋白的表達量都明顯上升，而LXA4干預治療組，TLR4及其下游的信號通路蛋白從轉錄水平和蛋白表達水平都有明顯的降低，與此同時膿毒癥的炎性反應和腦損傷作用也同時降低，給予TLR4激動劑劑Pam3Cys干預，TLR4及其下游信號通路被激活，炎性反應和腦損傷相較于治療組加重。以上結果共同說明了TLR4/NOX4/NF-κB通路參與了膿毒癥致腦損傷的致病過程。

綜上所述，TLR4/NOX4/NF-κB通路參與了膿毒癥致腦損傷的致病過程，脂氧素A4通過抑制膿毒癥大鼠腦組織中TLR4/NOX4/NF-κB通路的破壞作用，從而抑制炎癥因子如TNF-α、IL-1和IL-6表達活性以及膿毒癥大鼠炎癥的進一步發展，最終影響膿毒癥誘導的腦損傷的進展。