ApoE基因多態性與缺血性腦卒中合并2型糖尿病的相關性分析

邱碩程 何竹涵 黃志偉 王景 王建欣 楊繼章

腦卒中是一種因大腦動脈狹窄、閉塞或破裂而引起的腦血管疾病，導致臨床急性腦血流循環障礙綜合征,在老年患者中常見，具有高發病率的特點，現已成為中國居民造成死亡的首位原因[1]，近年來其發病率呈不斷上升趨勢[1,2]。其中缺血性腦卒中約占全部腦卒中的80%[3]，一項國內的調查顯示我國缺血性腦卒中的殘疾率達16.23%[4]。由此引起我國醫學界的高度重視，急性缺血性卒中的診斷與治療有了較大進展，隨著急性期血管再通治療的大型隨機對照臨床試驗及高質量Meta 分析，以及輕型腦卒中與短暫性腦缺血發作雙聯抗血小板治療的隨機對照臨床試驗結果的公布，產生了許多改變臨床實踐的新的循證醫學證據，特別是在靜脈溶栓和血管內治療擴大適應證方面取得了長足進步。伴隨著缺血性腦卒中的診斷與治療的進步，科研人員對其影響因素也在進行不斷地探討。在造成缺血性腦卒中的諸多因素中，2型糖尿病是一個重要的獨立危險因素[5]，隨著糖尿病病程的進展，可引起血管內皮損傷，進而促進動脈粥樣硬化的形成，增加缺血性腦卒中發生的風險[6]。載脂蛋白E(ApoE)是一種多態蛋白，在脂蛋白代謝中起到重要的作用，有研究表示ApoE基因多態性與缺血性腦卒中和2型糖尿病密切相關[7,8]。缺血性腦卒中合并2型糖尿病的高致殘率嚴重影響患者的自理能力，以及其高復發率和高死亡率給患者家庭及社會帶來了沉重的負擔[9]。本研究采用病例-對照的研究方法，探討ApoE基因多態性在缺血性腦卒中合并(不合并)2型糖尿病患者中的分布規律及可能的危險因素，旨為該類疾病的防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月至2019年2月于河北醫科大學第一醫院收治并確診為缺血性腦卒中的患者512例。根據患者是否合并2型糖尿病，分為缺血性腦卒中合并2型糖尿病(T2DM)組(164例)和缺血性腦卒中不合并2型糖尿病(NC)組(348例)。其中T2DM組男97例，女67例；平均年齡(66.59±10.18)歲；NC組男204例，女144例；平均年齡(66.22±11.20)歲。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 入選標準與排除標準

1.2.1 入選標準:①缺血性腦卒中的診斷標準符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南(2018)》[10]，并經頭顱CT和(或)磁共振(MRI)確診。② 2型糖尿病的診斷標準符合《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[11]中糖尿病診斷的相關標準。

1.2.2 排除標準:①合并血管炎患者；②合并嚴重肝腎功能不全患者；③診斷為短暫性腦缺血發作患者；④合并精神病及腫瘤患者；⑤原始資料不全等患者。

1.3 儀器與試劑 STEPONE PLUS實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；AU5800全自動生化分析儀(美國貝克曼公司)；HYDRASYS2全自動電泳儀(法國SEBIA公司)；TGL-18C離心機(上海安亭科學儀器廠)；PHARM-GENE 01 SNP分析保存液、PHARM-GENE 200 SNP分析樣本處理試劑、預處理液(北京華夏時代基因科技發展有限公司，批號：20160503)；人類ApoE基因型檢測試劑盒(武漢友芝友醫療科技股份有限公司)。

1.4 血生化指標檢測 入院后抽取患者空腹外周血5 ml，3 000 r/min離心10 min以分離血清，檢測空腹血糖、糖基化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血清肌酐(Cr)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌酸激酶(CK)等指標。

1.5 ApoE基因檢測 取患者血樣2 ml進行EDTA抗凝和DNA提取，將提取的DNA置于-20℃冰箱內保存，備用。將相關引物(上游為:5’-AGG GTG CTG ATG GAC GAG AC-3’,下游引物:5’-GCT CAC GGA TGG TGC TGA GG-3’) 加入上述提取的DNA中，進行多個循環的PCR擴增(37℃，10 min；95℃，5 min；95℃，15 s；60℃，60 s，40個循環)。設置FAM、VIC和ROX 3通道采集熒光信號。將擴增的產物樣本的熒光曲線用基因芯片閱讀儀讀取結果。

2 結果

2.1 患者一般臨床資料及生化資料比較 將生化指標(TC、TG、LDL-C、HDL-C、Cr、ALT、AST、CK)進行正態性檢驗，結果顯示均為非正態分布(P<0.05)，采用Mann-Whitney U檢驗。Mann-Whitney U檢驗和2檢驗的結果顯示，T2DM組與NC組在性別比、年齡、是否合并高血壓、是否合并高脂血癥、TC、LDL-C、Cr、ALT上比較無顯著差異(P>0.05)。T2DM組的TG含量比NC組高，且差異有統計學意義(P<0.05)，而在AST、CK和HDL-C上顯著低于NC組(P<0.05)。見表1。

表1 患者一般資料及生化資料比較

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 使用2檢驗對NC組患者ApoE的基因型分布頻率進行Hardy-Weinberg遺傳平衡驗證，結果顯示NC組基因型符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，表明該抽樣具有代表性。見表2。

表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

2.3 3組ApoE基因型及等位基因的分布特征比較 與NC組相比T2DM組的ApoE基因型及其等位基因頻率差異無統計學意義(P>0.05)。本次研究的512例缺血性腦卒中患者中，ApoE含3種等位基因(E2，E3，E4)和6種基因型(E2/E2，E2/E3，E2/E4，E3/E3，E3/E4，E4/E4)。其中分布頻率以等位基因ApoE3最多占比80.86%，ApoE4其次占比10.06%，ApoE2分布最少占比9.08%。E2/E2基因型3例(0.59%)、E2/E3基因型78例(15.23%)、E2/E4基因型9例(1.76%)、E3/E3基因型331例(64.65%)、E3/E4基因型88例(17.19%)、E4/E4基因型3例(0.59%)。見表3。

表3 2組ApoE基因型比較 例(%)

2.4 同性別各組基因型特征關系 將T2DM組與NC組按性別劃分進行比較，結果顯示T2DM組男性與NC組男性、T2DM組女性與NC組女性在ApoE基因型上亦無顯著差異(P>0.05)。見表4。

表4 按性別劃分T2DM組與NC組基因型比較 例(%)

2.5 合并2型糖尿病危險因素分析 以腦卒中患者是否合并2型糖尿病為因變量，將合并高脂血癥、合并高血壓、ApoE基因、TC、TG、LDL-C、HDL-C、Cr、ALT、AST、CK作為自變量，進行Logistic回歸分析。結果顯示，合并高脂血癥、合并高血壓、TG、HDL-C是缺血性腦卒中患者合并2型糖尿病的危險因素(P<0.05)，而ApoE基因不是缺血性腦卒中患者合并2型糖尿病的危險因素(P>0.05)。見表5。

表5 Logistic回歸分析

3 討論

ApoE是一種多功能蛋白，含有299個氨基酸，與體內脂蛋白的代謝密切相關，對于維持膽固醇平衡及血脂代謝起十分重要的作用。ApoE有3種等位基因(E2,E3,E4)，在人群中有6種不同的表型：3種純合子(E2/E2、E3/E3、E4/E4)與3種雜合子(E2/E3、E2/E4、E3/E4)。在亞洲進行的流行病學研究中表明ApoE3是最常見的基因型[12]。在本次研究的資料中ApoE3基因在腦卒中患者分布頻率最多(80.86%)，與以上研究結果相符。大量文獻報道，ApoE基因多態性對體內血脂代謝具有一定的影響，易導致一系列的心腦血管疾病[13,14]。缺血性腦卒中作為我國最主要的心血管疾病，分型比較多,危險因素十分復雜,且不同種族差異較大,導致ApoE基因與缺血性腦卒中的關系不是十分確定，但是仍然還是有大量研究表明，在亞洲人群中ApoEε4等位基因極有可能是缺血性腦卒中的危險因素，作用機制可能是影響了人體內血脂的水平[15]。同時ApoE基因多態性與糖尿病的發生及脂代謝紊亂也有一定關聯[14,16,17]。王阿元[18]的研究表明，2型糖尿病常伴有高脂血癥的現象；因此缺血性腦卒中患者發生2型糖尿病的風險是正常人的1.5～3倍[19]。Chen等[8]的Meta分析結果顯示ApoE的多態性與2型糖尿病的發生率有關。某些學者的研究結果顯示，ApoE4和E2基因可能與中國漢族人群2型糖尿病腎病、糖尿病周圍神經病變、糖尿病視網膜病變、糖尿病足、冠心病的風險增加有關[20-26]。但劉文秀等[27]對云南納西族ApoE基因對2型糖尿病患病率的影響相關研究顯示，在云南納西族中ApoE E4基因對2型糖尿病無影響，李悅等[28]對新疆維吾爾族ApoE基因的多態性與糖尿病患病率的研究結果也顯示ApoE與糖尿病無關。Srirojnopkun等[29,30]的研究也贊同ApoE基因多態性與糖尿病無關。

本研究NC組患者ApoE基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，表明抽樣具有代表性。在檢驗數據分布的正態性后采用Mann-Whitney U檢驗、2檢驗進行組間比較，結果顯示ApoE基因多態性與缺血性腦卒中患者是否合并2型糖尿病可能無關，且Logistic回歸分析顯示高脂血癥、高血壓、TG、HDL-C是缺血性腦卒中患者合并2型糖尿病的危險因素，而ApoE基因多態性不是其危險因素。該結果與劉文秀等[27,28]研究的結論相符，但與以上部分學者的研究結果尚有差異，其原因可能與地域民族的遺傳特異性、本研究的研究人群為缺血性腦卒中患者、基因-基因和(或)基因-環境的交互作用以及糖尿病及其并發癥機制的復雜性等因素有關。既往大量的研究表明，種族遺傳的差異不可忽視，近年Chen等[31]的研究就證實了ApoE基因型具有種族及地域特異性。本研究的對象為河北省漢族患者，與其他學者的研究對比具有一定局限性。同時上述學者的研究對象大多是在正常人群的基礎上發生有2型糖尿病及其并發癥，而本研究的群體為缺血性腦卒中患者，缺血性腦卒中患者危險因素的多元性可能會對結果有所影響。此外復雜疾病的發生發展往往會涉及到多個基因之間、基因與環境之間的交互作用，因而在與基因相關的研究中會產生很大的影響。糖尿病及其并發癥機制的復雜性使得研究很難從單一的基因角度對其進行分析，亦可能對研究結果產生影響。但同時發現高脂血癥、高血壓、TG、HDL-C為合并2型糖尿病的危險因素。徐國超等[32,33]的研究表明，患者血糖水平與HDL-C水平為負相關，與TG水平呈正相關,與本研究顯示的HDL-C和TG是糖尿病的危險因素之一相符。王阿元等[18,34]的研究表明，2型糖尿病會促使高血脂疾病發生及增加患者發生高血壓的風險，與本研究結果顯示的高血壓和高脂血癥是合并2型糖尿病的危險因素相符。

由于先前學者的研究大多是在正常人群中研究ApoE基因型和等位基因對其發生糖尿病或腦卒中的關系，對于特定的腦卒中群體不具有普遍適用性，在預防腦卒中患者并發癥的發生以及腦卒中可能存在的危險因素上具有局限性。對此本研究首次選擇在缺血性腦卒中患者人群中探究了ApoE基因多態性與其合并2型糖尿病的關系。但本研究在患者的篩選和統計分析中可能存在偏倚與缺漏；研究的樣本量相對較少，研究納入的范圍相對較小，未排除由于生活習慣以及環境等外在因素的作用，且不同地區和種族的遺傳差異可能會對結果造成影響。后期需加大樣本量、收集多地區多種族的患者資料、多因素篩選分析來進一步探究缺血性腦卒中患者ApoE基因多態性對于其合并2型糖尿病的影響。為臨床醫生和決策者在預防缺血性腦卒中患者并發2型糖尿病上提供參考。