肺癌組織中VEGF、EGFR表達與ADC直方圖相關參數的關系

李臻 耿廣 侯桂英 吳新娟 郭海榮 康若琛 李雯 紀俊雨 袁帥 張瑩 孫梅花

肺癌是我國發病率與死亡率最高的惡性腫瘤[1]，血管生成在腫瘤的發生、發展和轉移的過程中起著重要的作用，而血管內皮生長因子(VEGF)和表皮生長因子受體(EGFR)是兩種與腫瘤血管生成密切相關的重要蛋白分子，有研究表明，VEGF與EGFR在腫瘤血管生成中起協同作用，且VEGF與非小細胞肺癌患者的臨床分期、淋巴結轉移密切相關[2,3]。近年來磁共振彌散加權成像(DWI)直方圖分析的方法被應用于各種腫瘤的檢查中[4,5]，將腫瘤所有體素的ADC值進行統一分析，得出相關特征參數，可更好的反映腫瘤的異質性，且屬于無創操作，避免了肺穿活檢對患者造成的損傷。本研究擬分析肺癌ADC直方圖相關參數與肺癌組織中VEGF、EGFR表達量及淋巴結轉移的關系，判斷能否以ADC直方圖預測肺癌組織中相關蛋白的表達及淋巴結轉移。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年4月至2019年4月于我院行手術切除治療的肺癌患者，共納入32例患者，其中男20例，女12例;年齡39～72歲，平均年齡57.5歲;病理類型包括腺癌15例，鱗癌8例，小細胞癌5例，其他4例;淋巴結轉移15例，淋巴結未轉移17例。

1.2 納入與排除標準 納入標準：(1)病變包含直徑>3 cm的孤立性實性區域(團塊或實變)；(2)術前未接受放療、化療或其他抗癌治療；(3)術前接受肺部MRI檢查；(4)患者術中同時行縱隔淋巴結清掃以確定有無轉移。排除標準：(1)肺部MRI檢查圖像有較多運動或磁敏感偽影，影響數據測量者；(2)病變實性成分較小，亞實性或磨玻璃密度成分占比較大。

1.3 MR掃描序列與參數 采用我院1.5T 磁共振掃描儀(Magnetom avanto,Siemens healthcare,Germany)進行肺部MRI檢查，使用體部8通道表面線圈。在一次檢查中完成T1WI、T2WI與DWI掃描。T1WI與T2WI采取吸氣末屏氣掃描，T1WI掃描參數：TR 189 ms，TE9 ms，FOV33 cm，矩陣256×256，層厚4 mm，層間隔1.5 mm；T2WI掃描參數：TR2 200 ms，TE 90 ms，FOV 33 cm，矩陣320×320，層厚4 mm，層間隔1.5 mm。DWI采用單次激發自旋回波-平面回波成像序列(spin echo-echo planar imaging,SE-EPI),在自由呼吸狀態下由導航回波法的呼吸觸發采集圖像。b值分別取0、400和800 s/mm2，TR4 000 ms，TE48.9 ms，FOV33 cm，矩陣128×128，層厚4 mm，層間隔1.5 mm。

1.4 DWI圖像分析與測量 將所有患者的DWI圖像以DICOM格式從西門子工作站導出至個人電腦，用FireVoxel軟件(紐約大學，NY，USA)進行圖像分析。參考T1WI與T2WI圖像，在所有包含病變的層面手工勾畫ROI，范圍盡可能包含全部病變，包括壞死、囊變、出血區。以單指數模型計算ADC值，并繪制全病變ADC值直方圖。記錄其特征參數，包括峰度、偏度、熵、ADC平均數、ADC中位數、ADC標準差、病變體積和ADC第5、10、15、30、50、70、90百分位數(ADC5th、ADC10th、ADC15th、ADC30th、ADC50th、ADC70th、ADC90th)。其中ADC第n百分位數表示在該點n%組成直方圖的像素值位于其左側。

1.5 免疫組化染色與結果判定

1.5.1 免疫組化染色：所有組織塊經甲醛溶液固定與石蠟包埋，將每個組織塊進行厚度4 μm連續切片，其中1片行常規HE染色，其余切片平均分為2份，分別進行VEGF和EGFR免疫組化染色。采用免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法，實驗步驟按照試劑盒說明書進行。陽性對照由試劑公司提供，陰性對照由PBS液代替一抗得到。其中鼠抗人VEGF、EGFR單克隆抗體及通用型SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.5.2 判定方法：VEGF和EGFR的陽性部分位于細胞漿或細胞膜，呈棕黃色或棕褐色顆粒。VEGF和EGFR表達以細胞染色強度和細胞陽性百分率得分之和進行判定。隨機選擇5個高倍鏡視野(400倍)進行判斷：①無染色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，黃褐色記3分；② 5%<陽性率≤25%記1分，25%<陽性率≤50%記2分，陽性率>50%記3分。上述2項相加，0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(1+)，3～4分為中等陽性(2+)，5～6分為強陽性(3+)。

1.6 統計學分析 應用SPSS 16.0統計軟件，VEGF、EGFR表達和各ADC直方圖相關參數之間的相關性采用Spearman秩和相關分析，VEGF、EGFR表達和肺癌病理分型間的相關性采用Kruskal-Wallis單因素方差分析，VEGF、EGFR表達和肺癌淋巴結轉移間的相關性采用Mann-Whitney U檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 淋巴結轉移與ADC直方圖相關參數的關系 患者是否有淋巴結轉移與峰度呈顯著負相關(P=0.03)，與其余ADC直方圖相關參數無顯著相關(P>0.05)。見表1。

2.2 VEGF、EGFR表達與ADC直方圖相關參數的關系 VEGF表達與各ADC直方圖相關參數均無顯著相關(P>0.05)；而EGFR表達與ADC平均數、中位數、標準差、ADC50th、ADC70th、ADC90th均呈顯著負相關(P均<0.05)。見圖1，表1。

圖1 EGFR表達量與ADC平均數、標準差、ADC70th和ADC90th的關系

表1 ADC直方圖相關參數與VEGF、EGFR及淋巴結轉移的相關性

2.3 VEGF、EGFR表達與肺癌病理分型及淋巴結轉移的關系 VEGF、EGFR表達與肺癌病理分型間無顯著相關(P>0.05)，而VEGF、EGFR表達與淋巴結轉移顯著相關(P值分別為0.001和0.004)。見表2。

表2 VEGF、EGFR與不同病理類型和淋巴結轉移的關系

3 討論

磁共振檢查中的DWI序列，可于活體顯示腫瘤內水分子彌散情況，并以ADC值的大小評價水分子彌散程度。DWI被廣泛應用于各種腫瘤的研究中，在肺癌方面，ADC值在肺內腫塊良惡性的鑒別[4]、病理分型[5]及預后預測方面[6]均可發揮重要作用。常規測量ADC值是在腫瘤最大橫截面選取ROI(感興趣區)，取該區域的平均ADC值，同時避開空洞、出血、壞死區域，但該方法未將腫瘤整體納入測量范圍，容易產生測量偏倚。本研究將直方圖的方法引入肺癌ADC圖的測量，通過繪制肺癌ADC直方圖將全部病變體素納入測量范圍，并得到一系列直方圖相關參數(包括峰度、偏度、熵、ADC平均數、ADC中位數、ADC標準差、病變體積和ADC第5、10、15、30、50、70、90百分位數)，可更好的反應腫瘤的異質性。

VEGF是一種肝素結合同源二聚體糖蛋白，它屬于一個生長因子家族(還包括VEGFB、VEGFC、VEGFD和胎盤生長因子PIGF)。VEGF是腫瘤血管內皮細胞的特異性有絲分裂原，在缺氧狀態下，激活的癌基因和一系列細胞因子導致VEGF表達量升高，VEGF通過旁分泌方式特異性的作用于血管內皮細胞，促進腫瘤血管內皮細胞增殖和血管形成，同時使腫瘤血管通透性增高，促進血漿內纖維蛋白原外滲，為血管形成過程中的細胞遷移提供纖維網絡。VEGF是腫瘤血管生成的主要調節因子，且可作為肺癌靶向治療的潛在靶點[7-9]。EGFR是一種重要的酪氨酸激酶受體，在多種上皮性腫瘤細胞中呈高表達，EGFR與多種腫瘤細胞活動有關，如增殖、血管生成、轉移、凋亡抑制、化療及輻射抗性等，它能導致其下游信號傳遞過程異常激活，使細胞的轉化、增殖加快，抵抗細胞凋亡，細胞生存期延長，與腫瘤的發生、發展、預后以及治療反應等相關[10]。近年來以為表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)靶點的分子靶向治療研究較多，以“吉非替尼、厄洛替尼”為代表，臨床試驗顯示，EGFR-TKIs在EGFR突變人群有效率可達58%～83%，中位生存期提高至18 ～30個月[11-13]。

VEGF和EGFR在肺癌組織中呈高表達，且兩者具有相關性，這已被多項研究證實。如張冉等[3]得出VEGF和EGFR在原發性肺癌組織的表達率(68.25%和47.62%)均顯著高于肺良性病變組織(20.00%和13.33%)，且VEGF與EGFR的陽性表達呈正相關，兩者在原發性肺癌的發生發展中可能起協同作用。宋懿懿等[2]檢測了186例非小細胞癌(NSCLC)患者在不同臨床病理特征下VEGF和EGFR的表達，發現VEGF與NSCLC淋巴結轉移有相關性，EGFR在非吸煙、女性和腺癌組織中高表達，與淋巴結轉移及分期密切相關；且NSCLC組織中VEGF和EGFR的表達具有相關性。袁衛紅等[14]認為EGFR在NSCLC組織與癌旁組織(距腫瘤邊緣<3 cm)的表達率(88%、64%)均高于肺部良性病變(10%)，而距腫瘤邊緣>6 cm的正常肺組織表達率與肺部良性病變無顯著差異；且EGFR表達陽性的NSCLC患者術后6、12、18、24個月復發率均明顯高于EGFR表達陰性的患者，提示EGFR與NSCLC患者預后關系密切。

本研究發現，肺癌組織VEGF的表達與ADC直方圖各相關參數、肺癌病理分型(腺癌、鱗癌、小細胞癌及其他)均無顯著相關性(P>0.05)，而與患者是否有淋巴結轉移顯著相關(P=0.001)。探討腫瘤ADC直方圖相關參數與腫瘤相關因子關系的文獻較少。Meyer等[15,16]比較了宮頸癌和直腸癌的ADC直方圖相關參數與相應腫瘤的VEFG表達，兩種腫瘤均無顯著相關性(P>0.05)，與本研究結論類似，分析原因可能為：只有當b值小于200 s/mm2時，DWI才對組織灌注敏感，本研究b值分別取0、400和800 s/mm2，未包括小于200 s/mm2的b值，因此得到的ADC相關參數未反映組織灌注信息。

本研究中EGFR表達與ADC平均數、中位數、標準差、ADC50th、ADC70th、ADC90th均呈顯著負相關(P均<0.05)。Meyer等[15]在一項對宮頸癌的研究中，得出EGFR的表達與ADC平均數、中位數、眾數、ADC10th、ADC25th、ADC75th、ADC90th均呈顯著負相關(P均<0.05)；在其對直腸癌[16]的研究中，得出EGFR僅與ADC最大值顯著相關(P=0.02)，而與其他ADC直方圖相關參數均無相關性。雖然腫瘤類型、部位不同，但兩項研究都傾向于認為ADC高值百分數與EGFR有顯著相關。本研究團隊之前有一項研究以ADC直方圖鑒別肺部病變良惡性，發現肺癌的偏度、峰度、平均數、標準差、ADC50th、ADC70th、ADC90th均低于肺部良性病變[17]。所以與其他參數相比，ADC高值百分數可能與EGFR及病變惡性程度有更好相關性，即ADC高值百分數越高，EGFR表達越少，且病變惡性程度越低。為何ADC高值百分數較其低值百分數能更好的反映組織EGFR的表達及惡性程度，一個可能的解釋是:肺癌較肺部良性病變含有更多的黏液、微出血 與組織紊亂成分，這些成分均導致水分子彌散受限,進而ADC值減小,而ADC高值百分數可更好地反映這些成分的影響。

本研究中ADC直方圖的峰度與患者是否有淋巴結轉移呈負相關(P=0.03)。峰度反映的是直方圖形態的陡峭程度，峰度越大，直方圖的形態越陡峭。以正態分布圖像為標準，正態分布的峰度系數為3，峰度<3的直方圖則相對于正態分布平緩，而峰度>3的直方圖則相對于正態分布陡峭。峰度越高，腫瘤的內部結構越致密。本結果說明，伴有淋巴結轉移的肺癌ADC直方圖較未發生淋巴結轉移者更加平緩，即肺癌內部結構越致密越不易發生淋巴結轉移。

VEGF與EGFR的表達與肺癌的病理類型無關，但與患者是否有淋巴結轉移顯著相關，這已在多項研究[18,19]得到證實。

肺癌組織中EGFR表達與多個ADC直方圖相關參數尤其是ADC高值百分數呈負相關，而VEGF表達卻與其無相關性。淋巴結轉移與ADC直方圖的峰度呈顯著相關。DWI檢查中的ADC直方圖相關參數可以用于肺癌組織中EGFR水平及是否有淋巴結轉移的預測，具有一定臨床應用價值。