亞甲藍(lán)影響異氟烷對老年阿茨海默病小鼠神經(jīng)毒性的研究

周裕凱，余 茹，張先杰，夏樂強(qiáng)

隨著找國人口老齡化，全身麻醉藥物對老年患者神經(jīng)毒性的研究成為麻醉學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，但因缺乏血液特異性標(biāo)志物，且受倫理限制無法獲得人大腦切片，該類研究多集中在基礎(chǔ)領(lǐng)域。

異氟烷（isoflurane，Iso）作為吸入麻醉藥，能通過影響淀粉樣β(amyloid-β，Aβ)蛋白在細(xì)胞外累積和異常表達(dá)的磷酸化Tau（phosphorylated tau,p-Tau）蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成，加速老年常見神經(jīng)退行性疾病——阿茨海默病（Alzheimer's disease,AD）的病理過程[1-2]。鋰鹽、黃芪甲苷和甘草酸苷等均被證實(shí)能在動(dòng)物模型中減輕異氟烷神經(jīng)毒性，起到保護(hù)作用[3-5]。

亞甲藍(lán)（methylene blue，MB）是一種陽離子噻嗪類染色劑，最早在上世紀(jì)90年代，被發(fā)現(xiàn)能減緩AD病理過程[6]，其衍生合成的新藥能治療輕、中度AD[7]。亞甲藍(lán)還能通過NO-鳥苷酸環(huán)化酶信號通路和異氟烷產(chǎn)生交互影響[8]，但其能否減輕異氟烷神經(jīng)毒性，目前尚缺乏相關(guān)報(bào)道。

本研究通過老年AD小鼠模型，觀察了行為學(xué)表現(xiàn)和蛋白表達(dá)，旨在探討亞甲藍(lán)對異氟烷神經(jīng)毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 采用南京生物醫(yī)藥研究院提供的12月齡雄性C57BL/6野生型小鼠(WT鼠)和C57BL/6 AD轉(zhuǎn)基因APP695小鼠（APP鼠），生產(chǎn)許可證為[SCXK（蘇）2015-0001]。飼養(yǎng)于重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司SPF級動(dòng)物房，使用許可證為[SYXK（渝）2019-0002]。保持動(dòng)物房12～12 h晝夜交替，溫度23～25℃，自由飲水、進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究通過德陽市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，審查號：2020-04-180。

1.2 分組及處理方法 WT鼠和APP鼠共分為4組。WTMB組和APPMB組：經(jīng)尾靜脈注入2 mg/kg亞甲藍(lán)（濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號為1406012）15 min后，放入有機(jī)玻璃盒子(5 cm×5 cm×15cm)吸入100%氧氣（1 L/min）；APPMB+Iso組：注入2 mg/kg亞甲藍(lán)后吸入1 U最低肺泡濃度（minimum alveolar concentration，MAC）異氟烷（山東魯南貝特制藥有限公司，批號為64140302），氧流量為1 L/min；APPIso組：注射同體積生理鹽水后吸入1 U MAC異氟烷。吸入氧氣或異氟烷都為4 h，保持小鼠直腸溫度在36～38℃。

MAC是指吸入麻醉藥在一個(gè)大氣壓下與純氧同時(shí)吸入時(shí)，能使50%患者在切皮時(shí)不發(fā)生反應(yīng)時(shí)的最低肺泡濃度，是不同吸入麻醉藥的等效價(jià)濃度。為排除亞甲藍(lán)對異氟烷MAC的影響[9]，根據(jù)Li等[10]報(bào)道的方法進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，測得APPMB+Iso組和APPIso組異氟烷的1 MAC均為1.4%。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 每組5只小鼠，共20只。采用直徑1.2 m，高0.6 m，水深0.4 m的圓形水池（安徽正華生物儀器設(shè)備公司），水溫為20～22℃，直徑0.2 m的逃生平臺設(shè)在水池西北角，淹沒于水下1 cm。定位航行實(shí)驗(yàn)：經(jīng)處理后的第1 d，小鼠被訓(xùn)練從水池4個(gè)不同象限邊界出發(fā)尋找逃生平臺，每只小鼠4次，如超過60 s，將人為引導(dǎo)到平臺并逗留20 s，連續(xù)4 d，每次持續(xù)60 s，每次間隔5 min，評估小鼠學(xué)習(xí)能力。空間探索實(shí)驗(yàn)：每天最后一次訓(xùn)練后，將小鼠放入移去平臺的水池中，每只小鼠仍從4個(gè)不同象限起點(diǎn)出發(fā)尋找原平臺位置，共4次，以評估記憶能力。攝像系統(tǒng)記錄60 s內(nèi)潛伏時(shí)間、速度和穿臺次數(shù)等行為學(xué)數(shù)據(jù)。

1.4 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 每組9只小鼠，共36只。經(jīng)處理后第1、3、7 d，每組分別取3只處死，提取海馬組織萃取蛋白，經(jīng)10%SDS凝膠電泳（美國Amresco公司）分離轉(zhuǎn)膜，采用含5%脫脂牛奶和0.1%聚山梨酸酯的緩沖鹽水（pH7.6）封膜2 h，4℃下與抗體孵化過夜。抗體（美國Abcam公司）包括：多克隆兔p-Tau抗體（1∶500）、多克隆兔Aβ1～42抗體（1∶500）、多克隆兔β-actin（1∶1000）。第2 d，用辣根過氧化物酶復(fù)合物（美國Sigma公司）作第二抗體在室溫下孵化1.5 h,采用凝膠成像系統(tǒng)（美國Wealtec公司）分析印跡條帶積分吸光度。以β-actin為內(nèi)參蛋白，目的蛋白吸光度與內(nèi)參蛋白吸光度比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件分析，計(jì)量資料以±s表示。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)用重復(fù)測量方差分析，組間多重比較采用Games-Howell法；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)用單因素方差分析，組間多重比較采用Games-Howell法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)與記憶能力比較 定位航行實(shí)驗(yàn)中，WTMB組學(xué)習(xí)能力最佳，隨訓(xùn)練時(shí)間延長，潛伏時(shí)間降低最明顯，與其余3組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；APPIso組學(xué)習(xí)能力最差，潛伏時(shí)間曲線最平緩，較其余組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；APPMB+Iso組潛伏時(shí)間改善幅度明顯差于APPMB組（P＜0.05）。見圖1A。

所有組在空間探索實(shí)驗(yàn)的運(yùn)動(dòng)能力未受影響，平均速度無明顯差別（P＞0.05），見圖1B。WTMB組記憶能力最好，表現(xiàn)為穿臺次數(shù)明顯多于其余3組（P＜0.05）；APPIso組記憶能力最差，穿臺次數(shù)明顯少于其余組（P＜0.05）；APPMB組和APPMB+Iso組穿臺次數(shù)無明顯差異（P＞0.05），見圖1C和圖2。

圖1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中學(xué)習(xí)與記憶能力的比較

圖2 Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡

2.2 Aβ1～42蛋白和p-Tau蛋白比較 WTMB組Aβ1～42蛋白和p-Tau蛋白水平平穩(wěn)，組內(nèi)變化隨時(shí)間延長，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；APPMB組蛋白隨時(shí)間延長明顯增加（P＜0.05）；APPMB+Iso組和APPIso組蛋白水平第1 d達(dá)到頂峰，后隨時(shí)間延長明顯明顯下降（P＜0.05）。見圖3和表1。

第1、3 d蛋白水平，4組間有明顯差別（P＜0.05），WTMB組最低，APPIso組最高，APPMB組明顯低于APPMB+Iso組（P＜0.05）。第7 d時(shí)，APPMB組、APPMB+Iso組和APPIso組間的Aβ1～42蛋白差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；APPMB組和APPMB+Iso組間的p-Tau蛋白差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

3 討論

為節(jié)約研發(fā)時(shí)間和成本，現(xiàn)代藥學(xué)傾向于拓寬已批準(zhǔn)藥物的適應(yīng)證。近期發(fā)現(xiàn)，靜脈注射地塞米松也能減輕異氟烷對新生野生大鼠的神經(jīng)毒性，改善受損神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)[11]。本研究選用了易透過血腦屏障的亞甲藍(lán)，它被發(fā)現(xiàn)能減輕AD、缺血性腦卒中、外傷性腦損傷等神經(jīng)學(xué)損害[12-14]。

圖3 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)Aβ1～42蛋白和p-Tau蛋白表達(dá)電泳圖

首先，為排除因小鼠性別不同造成神經(jīng)損傷程度的差異[15]，本研究只選用雄性小鼠。靜脈注射0.5～4 mg/kg亞甲藍(lán)能緩解AD進(jìn)程[16-17]，但其劑量>5 mg/kg可能會(huì)降低異氟烷MAC[9]，為排除這一干擾因素，本研究先行預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2 mg/kg亞甲藍(lán)不影響異氟烷MAC，APPMB+Iso組和APPIso組1 U MAC均為1.4%，與Li等[10]報(bào)道的同種小鼠異氟烷MAC相同。

定位航行實(shí)驗(yàn)中（圖1A），4組潛伏時(shí)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），說明異氟烷損傷老年AD小鼠學(xué)習(xí)能力，亞甲藍(lán)能減輕該損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。空間探索實(shí)驗(yàn)中，異氟烷和亞甲藍(lán)均不影響小鼠運(yùn)動(dòng)能力；APPMB組和APPMB+Iso組穿臺次數(shù)無明顯差異（P＞0.05），APPIso組穿臺次數(shù)明顯少于其余組（P＜0.05）（圖1C和圖2），說明異氟烷對AD小鼠記憶無負(fù)面影響，亞甲藍(lán)能改善AD小鼠記憶。Chen等[18]也發(fā)現(xiàn)亞甲藍(lán)能改善AD大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，海馬體注入含36 g亞甲藍(lán)納米復(fù)合體后，潛伏時(shí)間明顯改善（P＜0.05），目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯延長（P＜0.05）且不影響運(yùn)動(dòng)能力（P＞0.05）。異氟烷對AD小鼠模型行為學(xué)的影響尚有爭議，Joseph等[19]發(fā)現(xiàn)14～16月齡AD小鼠連續(xù)5 d吸入1.1%異氟烷2 h，學(xué)習(xí)能力受損嚴(yán)重（P＜0.05），記憶能力無顯著影響（P＞0.05）；趙燕星等[20]則發(fā)現(xiàn)7月齡AD雙轉(zhuǎn)基因APPswe/PS1dE9小鼠連續(xù)5 d吸入1.1%異氟烷2 h后，學(xué)習(xí)、記憶能力反而有一定提高（P＜0.05）。這可能與動(dòng)物種類、月齡、測試方法等不同有關(guān)，其中機(jī)理需進(jìn)一步探索和研究[19]。

蛋白水平的影響比行為學(xué)持久，故選擇經(jīng)處理后第1、3、7 d進(jìn)行檢測，結(jié)果提示異氟烷的神經(jīng)損傷也體現(xiàn)在蛋白水平，而亞甲藍(lán)不光能減輕異氟烷的損傷，還能降低APPMB組蛋白水平，改善AD病程（圖3和表1）。第7 d時(shí)，3組APP鼠間的Aβ1～42蛋白，APPMB組和APPMB+Iso組的p-Tau蛋白已無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說明吸入1.4%異氟烷4 h對AD小鼠神經(jīng)損傷是可逆的，單次靜脈注射2 mg/kg亞甲藍(lán)在蛋白水平的保護(hù)作用也不持久。

亞甲藍(lán)減輕異氟烷神經(jīng)毒性，產(chǎn)生保護(hù)作用的機(jī)理，推測與線粒體有關(guān)。線粒體功能失調(diào)是異氟烷介導(dǎo)神經(jīng)損傷的重要靶點(diǎn)，包括改變線粒體形態(tài)、降低膜電位、破壞電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅳ和增加活性氧簇，從而觸發(fā)半胱天冬酶途徑的細(xì)胞凋亡[21-22]。線粒體也是亞甲藍(lán)治療AD的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，亞甲藍(lán)可通過增加復(fù)合體Ⅳ活性，促進(jìn)線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制淀粉樣復(fù)合乙醇脫氫酶和減少氧化應(yīng)激標(biāo)志物，從而降低Aβ蛋白和p-Tau蛋白水平，抑制Aβ寡聚物和Tau蛋白纖維形成[23]。

表1 小鼠海馬組織中蛋白和p-Tau蛋白表達(dá)水平(?，n=9)

表1 小鼠海馬組織中蛋白和p-Tau蛋白表達(dá)水平(?，n=9)

注：與同天WTMB組比較，①P＜0.05；與同天APPMB組比較，②P＜0.05；與 同天組比較，③P＜0.05；與組內(nèi)第1 d比較，④P＜0.05

Aβ/β-actin 組別 第1 d 第3 d 第7 d WT 0.2482±0.0146 0.2504±0.0079 0.2530±0.0141 APP 0.6438±0.0380 0.6937±0.0139 0.7500±0.0452 APP 1.4857±0.0271 1.5921±0.0502 1.0781±0.1048 p-Tau/β-actin 組別 第1 d 第3 d 第7 d WT 0.1504±0.0021 0.1557±0.0072 0.1518±0.0078 APP 0.2908±0.0030 0.3220±0.0090 0.3927±0.0062 APP 0.8037±0.0369 0.5627±0.0446 0.4060±0.0098 APP 1.1306±0.0713 0.8224±0.0177 0.6046±0.0084

綜上所述，靜脈注射2 mg/kg亞甲藍(lán)能減輕異氟烷對老年AD小鼠的神經(jīng)毒性，但其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。麻醉藥物神經(jīng)毒性的研究需要拓寬思路，發(fā)現(xiàn)更多有潛在保護(hù)機(jī)制的藥物，以期待未來能用于臨床中。