青藤堿對(duì)荷前列腺癌裸鼠抗腫瘤作用的初步研究

唐炬光 賴小斌 朱志華 盧本銘 彭瑞英

摘要：目的：研究青藤堿對(duì)荷前列腺癌裸鼠抗腫瘤作用。方法：將荷PC3前列腺癌小鼠按照隨機(jī)對(duì)照原則，為模型A組、青藤堿B組、雷帕霉素C組、青藤堿+1/2雷帕霉素D組，每組各15例裸鼠，一共4組。各組均采取腹腔注射給藥。其中模型A組每天注射生理鹽水0.2ml，青藤堿B組每天注射青藤堿40mg/kg，雷帕霉素C組每天注射雷帕霉素20 mg/kg，青藤堿+1/2雷帕霉素D組每天注射青藤堿40mg/kg和雷帕霉素10mg/kg。自給藥日起，每隔2 d測(cè)定腫瘤體積1次，并觀察每組小鼠的死亡情況并做記錄。給藥12天后，觀察各組裸鼠精神狀態(tài)、體重及腫瘤體積，處死裸鼠，取各組腫瘤組織，采取Western-blot法檢測(cè)各組caspase-3，ELISA法檢測(cè)IL-6、IL-8、TGF-β，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組Treg，HE染色法檢測(cè)各組移植瘤的病理情況，留取各組裸鼠靜脈血，不良反應(yīng)發(fā)生率以檢測(cè)各組肝腎功能情況表示。結(jié)果：D組對(duì)荷瘤裸鼠的腫瘤抑制作用優(yōu)于A組、B組、C組（P<0.05）;D組對(duì)腫瘤的抑制率優(yōu)于A、B、C組（P<0.05）。同時(shí)各組給藥前后裸鼠的體質(zhì)量并未出現(xiàn)明顯的增加或減少，對(duì)裸鼠的肝臟也未見有明顯的影響。與A組相比，B組、C組、D組均可抑制腫瘤體積的增長，降低腫瘤組織中VEGF的表達(dá)水平，D組對(duì)腫瘤抑制作用更佳，且未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)（P<0.05）;與A組相比，B組、C組、D組均可降低患者IL-6、IL-8、TGF-β水平，D組對(duì)降低IL-6、IL-8、TGF-β水平效果更佳（P<0.05）。結(jié)論：青藤堿可以提高抑瘤率，抑制腫瘤體積的增長，降低患者IL-6、IL-8、TGF-β水平，且未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，具有較好的安全性。

關(guān)鍵詞：青藤堿;荷前列腺癌;裸鼠;抗腫瘤

前列腺癌（Prostate cancer，PCa）是男性最常見的三大癌癥之一，最新統(tǒng)計(jì)表明前列腺癌的發(fā)病率在中國65歲以上的男性中呈現(xiàn)快速增長的趨勢(shì)[1]。雖然在前列腺癌的起病階段可以通過手術(shù)、放療、雄激素剝奪療法（Androgen deprivation therapy，ADT）等進(jìn)行成功治療，但是幾乎所有晚期前列腺癌患者最終都會(huì)進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌（Castration resistant prostate cancer，CRPC），并對(duì)一線ADT和其他激素療法產(chǎn)生內(nèi)在或獲得性抗性[2]。中醫(yī)藥在治療西醫(yī)認(rèn)為的疑難雜癥具備顯著的有優(yōu)勢(shì)。尤其在腫瘤的防治上，更是積累了大量的臨床經(jīng)驗(yàn)，也取得了一系列的臨床療效，研究前景廣闊。本研究結(jié)合青藤堿在多種腫瘤的防治效果研究，認(rèn)為本研究設(shè)計(jì)方案合理，可行性大，為青藤堿在前列腺癌的防治上積累可靠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資料，同時(shí)也為中醫(yī)藥在腫瘤的防治上提供重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料及試劑

人前列腺癌PC-3細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。BALB/c裸鼠（SPF級(jí)），♂，體質(zhì)量22～25 g，鼠齡4～6周（由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，浙江大學(xué)動(dòng)物中心養(yǎng)殖，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK2012-0178）;血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）（150?L，谷歌生物公司，批號(hào)：GB11034）。

1.2 方法

PC3前列腺癌小鼠模型的建立常規(guī)培養(yǎng)PC3細(xì)胞，維持細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，調(diào)節(jié)活細(xì)胞濃度，使每只裸鼠分別接種2×106細(xì)胞，溶于150μLPBS和50μL基質(zhì)膠，將腫瘤細(xì)胞注射于裸鼠腋窩皮下，注射后有鼓包出現(xiàn)且持續(xù)一段時(shí)間視為接種成功。1周后檢查裸鼠是否成瘤。7天后出現(xiàn)腫瘤節(jié)點(diǎn)，建立DU145荷瘤裸鼠模型。共接種60只雄性裸鼠，每3天測(cè)量記錄一次體重和腫瘤體積，實(shí)時(shí)觀察生活狀態(tài)。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）給藥12天后，比較不同給藥組對(duì)荷瘤裸鼠的腫瘤抑制作用。

（2）給藥12天后，觀察各組裸鼠精神狀態(tài)、體重及腫瘤體積，腫瘤體積=（腫瘤長徑×腫瘤寬徑2）/2，抑瘤率=（模型組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。同時(shí)取裸鼠的肝臟進(jìn)行稱重，并將瘤塊用甲醛固定，進(jìn)一步進(jìn)行免疫組化分析。

（3）留取各組裸鼠靜脈血，不良反應(yīng)發(fā)生率以檢測(cè)各組肝腎功能情況表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 不同給藥組對(duì)荷瘤裸鼠的腫瘤抑制作用

給藥后各給藥組對(duì)移植瘤體積的增長都有抑制作用。其中A組的抑制作用相對(duì)較差，腫瘤體積從（200.36±26.99）mm3增長到了（605.81±15.31）mm3，B組的腫瘤體積從（201.71±72.77）mm3增長到了（245.09±38.57）mm3，C組的腫瘤體積從（197.36±35.99）mm3增長到了（400.78±28.09）mm3，D組的腫瘤體積從（196.24±24.87）mm3增長到了（222.24±14.87）mm3，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 各組荷瘤小鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、瘤塊質(zhì)量及抑瘤率的比較

D組對(duì)腫瘤的抑制率優(yōu)于A、B、C組（P<0.05）。同時(shí)各組給藥前后裸鼠的體質(zhì)量并未出現(xiàn)明顯的增加或減少，對(duì)裸鼠的肝臟也未見有明顯的影響，結(jié)果見表1。

2.3 各組大鼠血清細(xì)胞因子水平比較

與A組相比，B組、C組、D組均可降低患者IL-6、IL-8、TGF-β水平，D組對(duì)降低IL-6、IL-8、TGF-β水平效果更佳（P<0.05）。見表2。

2.4 兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生率的比較B216F225-7544-4ACC-A9CB-09939424259D

各給藥組荷瘤裸鼠在給藥后未見明顯的活動(dòng)減少、便秘、腹瀉等不良反應(yīng)，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3討論

在泌尿外科中，前列腺癌是最常見的惡性腫瘤之一。前列腺癌是雄性激素敏感性腫瘤，治療方式一般是在癌癥早期采用雄激素剝奪療法或睪丸切除治療。然而，隨著時(shí)間的推移，前列腺癌的生長變得不依賴于雄性激素治療，但是該藥物療效有限，并且毒性大，不良反應(yīng)嚴(yán)重，這無疑降低了人們對(duì)于這些藥物治療的期望[3]。中醫(yī)藥在治療西醫(yī)認(rèn)為的疑難雜癥具備顯著的優(yōu)勢(shì)。尤其在腫瘤的防治上，更是積累了大量的臨床經(jīng)驗(yàn)，也取得了一系列的臨床療效標(biāo)準(zhǔn)，研究前景廣闊。

本研究將青藤堿運(yùn)用在裸鼠中，研究結(jié)果顯示，給藥后各給藥組對(duì)移植瘤體積的增長都有抑制作用，且將青藤堿與雷帕霉素聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。另外，本研究結(jié)果還顯示，青藤堿與雷帕霉素聯(lián)合應(yīng)用裸鼠的體質(zhì)量并未出現(xiàn)明顯的增加或減少，對(duì)裸鼠的肝臟也未見有明顯的影響，分析其原因在于從中藥白樺中提取出的白樺脂酸可顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長，該效應(yīng)是通過上調(diào)抑癌基因p53表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。苦參堿、莪術(shù)尤其具有抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制是這些藥物抑制了bcl-2的表達(dá)，而bcl-2屬于凋亡抑制基因，降低bcl-2意味著加速腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)健康。中藥青風(fēng)藤味苦，能祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)和利小便，另外青藤堿（SIN）是從青風(fēng)藤提取出來的有效活性單體，具有免疫抑制和抗炎作用[4]。本研究將青藤堿運(yùn)用在裸鼠中，研究結(jié)果顯示與A組相比，B組、C組、D組均可降低患者IL-6、IL-8、TGF-β水平，D組對(duì)降低IL-6、IL-8、TGF-β水平效果更佳，且兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生率的比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

綜上所述，青藤堿可以提高抑瘤率，抑制腫瘤體積的增長，降低患者IL-6、IL-8、TGF-β水平，且未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，具有較好的安全性。

參考文獻(xiàn)

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[4]袁璞.MRI引導(dǎo)下基于TiO2的納米系統(tǒng)在前列腺癌治療中的應(yīng)用[D].鄭州大學(xué)，2019.B216F225-7544-4ACC-A9CB-09939424259D