來曲唑聯合高糖高脂飲食構建多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗大鼠模型研究

王景尚 尹曉丹 何軍琴 武 穎 張 瑩 李憲銳

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院中醫科，北京 100026)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是青春期和育齡期婦女最常見的一種復雜的內分泌紊亂綜合征，是導致女性不孕癥發生的主要病因之一[1]。我國PCOS患者人群龐大，據統計在育齡期女性中的發病率高達5%～10%[2]。PCOS不僅影響女性的生殖功能，而且會使患者2型糖尿病、代謝綜合征及心腦血管疾病等遠期并發癥的發病風險顯著高于一般人群,并可持續到絕經后，其機制被認為與PCOS患者的胰島素抵抗(insulin resistance, IR)狀態有關[3-4]。臨床流行病學研究[5]顯示，PCOS患者伴有IR(polycystic ovary syndrome with insulin resistanc，PCOS-IR)的比例高達50%～70%，同時具有高發性、異質性、終身性、難治性等特點，嚴重影響女性身心健康，成為臨床和基礎研究的熱點和難點。建立可靠、簡便、符合臨床特征的PCOS-IR動物模型對于推動該病的深入研究具有重要意義。本課題組前期通過高糖高脂飲食喂養的方法成功構建了IR及糖代謝異常大鼠模型，并經過反復驗證[6]。本研究在此基礎上，應用高糖高脂飲食和來曲唑灌胃的方法誘導構建PCOS-IR大鼠模型，分析其內分泌、胰島素抵抗和卵巢病理改變特征，旨在建立一種有效的、更加符合人體生理病理特征的PCOS-IR動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡SPF級雌性SD大鼠20只，體質量160～180 g，購自北京大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0010。飼養條件為2級，室溫保持在(22±2)℃，相對濕度(55±5)%，光照時間7:00～19:00。

1.2 動物飼料、藥物及試劑

動物飼料購自購自北京科澳協力飼料有限公司，其中高脂飼料含豬油20%、蔗糖10%、膽固醇1.25%、膽酸鹽0.25%，普通飼料68.5%；來曲唑購自大連美侖生物技術有限公司；羅氏活力型血糖儀試紙購自德國羅氏診斷有限公司；血清促卵泡生成素(follicle stimulating hormone, FSH;批號：CSB-E06869r)、促黃體生成素(luteinizing hormone，LH;批號：CSB- E12654r)、睪酮(testosteron，T;批號：CSB-E05100r)及空腹胰島素(fasting insulin，FINS;批號：CSB-E05070r)、ELISA試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 模型構建

大鼠普通飼料適應性喂養1周后，隨機數字表法選取10只作為對照組，其余10只作為模型組。對照組給予普通飼料，模型組給予高糖高脂飼料喂養28 d。于喂養第8天，模型組大鼠開始每日用0.4 mL溶于1%(質量分數)羧甲基纖維素溶液(carboxymethyl cellulose solution，CMC)的來曲唑液(1 mg·kg-1·d-1)灌胃，對照組灌服0.4 mL 1%(質量分數)CMC溶液。自灌胃第7天開始每天早晨行陰道涂片，觀察陰道脫落細胞的周期變化，判斷動情周期。連續觀察至第21天，模型組大鼠均喪失完整動情周期，對照組大鼠均處于動情前期時，結束灌胃，以觀察基礎卵泡及性激素變化。灌胃結束后，各組大鼠在取材前一晚20：00開始禁食水，次日用1%(質量分數)水合氯醛麻醉，尾靜脈采血，用羅氏血糖儀測定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)濃度并記錄。隨后經腹主動脈取血，收集血清標本置-80 ℃保存備用。迅速摘取雙側卵巢，放入4%(質量分數)多聚甲醛液固定。

1.4 指標檢測

1.4.1 大鼠一般情況及陰道細胞學檢測

每日觀察大鼠活動、飲食、大小便及毛色等情況，每周稱體質量1次；自實驗開始第15 d起，每天早晨行陰道涂片，觀察陰道脫落細胞的周期變化，判斷動情周期，直至實驗結束。

1.4.2 大鼠血清性激素測定

取大鼠血清，采用ELISA法測定大鼠FSH、LH及T濃度，具體操作嚴格按照說明書進行。

1.4.3 大鼠血糖、胰島素濃度測定與評估

用羅氏血糖儀測定FBG濃度,ELISA法測定FINS濃度。采用胰島素抵抗指數(insulin resistance index，HOMA-IR)及胰島素敏感指數(insulin sensitivity index,ISI)評估IR程度。HOMA-IR=FBG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5。ISI=1/ FINS (mU/L)×FBG(mmol/L)[7]。

1.4.4 大鼠卵巢組織學形態觀察

應用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法觀察大鼠卵巢組織形態。取出經4%(質量分數)多聚甲醛固定的卵巢組織，常規組織脫水，石蠟包埋；將卵巢組織切成5 μm厚切片，常規脫蠟、水化后經HE染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察兩組大鼠卵巢組織病理學變化。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠一般情況及體質量的變化情況

2組大鼠飲食、活動、大小便及毛色均未見明顯異常，實驗期間2組未見大鼠死亡。造模前2組大鼠體質量差異無統計學意義，造模后2組大鼠體質量均較造模前顯著增加，差異有統計學意義，造模后模型組與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01),詳見表1。

2.2 大鼠動情周期觀察

正常雌性大鼠性成熟后，隨激素變化會產生4～5 d 規律的動情周期。本研究結果顯示，造模前大鼠動情周期穩定，光學顯微鏡下陰道涂片觀察可見成熟的角化脫落上皮，到動情前期出現有核上皮細胞，出現規律動情周期，典型變化詳見圖1； 造模后10只大鼠的陰道角化和有核上皮數量均明顯減少，以角化上皮減少為主，動情期間和動情期后白細胞增加，角化上皮脫落減少，動情期縮短，動情間期延長，提示模型大鼠均失去動情周期變化，典型變化詳見圖2。

圖1 對照組大鼠1～15 d陰道涂片典型變化情況

圖2 模型組大鼠1～15 d陰道涂片典型變化情況

2.3 大鼠血糖及胰島素抵抗變化情況

與對照組相比，模型組FBG、FINS及HOMA-IR指數升高(P<0.01),ISI濃度降低(P< 0.01),差異均有統計學意義，詳見表2。

表2 各組大鼠血糖及胰島素抵抗情況比較

2.4 大鼠血清性激素變化情況

與對照組相比，模型組FSH降低(P<0.01)，T、LH濃度及LH/FSH比值均明顯升高(P<0.01)，差異均有統計學意義。提示模型組大鼠出現顯著的高雄激素狀態和激素分泌異常，詳見表3。

表3 各組大鼠血清性激素濃度比較

2.5 大鼠卵巢HE染色情況

對照組大鼠鏡下可見多個不同發育時期的卵泡和黃體，極少見囊性擴張卵泡，卵泡內顆粒細胞層較厚，排列整齊，卵泡膜細胞8～9層；光鏡下，多囊卵巢綜合征的典型形態學特征為：各級發育卵泡數量減少、有囊性擴張的卵泡、閉鎖卵泡、黃體組織比例減少、卵泡顆粒細胞層減少或消失、泡膜細胞增生。模型組10只大鼠卵巢均呈現出典型的多囊樣改變，可見囊狀擴張卵泡，卵泡內顆粒細胞層減少至2～3層，排列疏松，卵泡膜細胞增生，詳見圖3。

圖3 2組大鼠卵巢組織HE染色(光鏡,100×)

3 討論

PCOS是女性最常見的內分泌代謝異常性疾病，主要臨床特征為持續性無排卵、高雄激素和卵巢多囊樣改變。近年來研究[3,8]顯示，約50%～70%的 PCOS患者存在明顯IR，10%的PCOS患者伴有糖尿病，同時PCOS-IR患者遠期出現2型糖尿病的風險亦顯著升高，提示了IR在PCOS發生發展過程中的重要作用。IR作為 PCOS最重要的病理生理機制，是導致PCOS患者超重和肥胖的主要原因，同時超重和肥胖也加重了PCOS的內分泌和代謝紊亂[9]。在臨床中，PCOS-IR患者較單純PCOS的病理機制更加復雜、治療難度也更大，明確其發病機制并進行有效的治療仍是目前研究的熱點和難點，而構建可靠、簡便、符合臨床特征的動物模型是進行相關研究的前提。

目前存在多種成熟的制備PCOS動物模型的方法，比如：芳香化酶抑制劑造模法、胰島素聯合人絨毛膜促性腺激素模法、孕激素聯合人絨毛膜促性腺激素造模法、雄激素造模法，皮下注射丙酸睪丸酮聯合高脂飼料飲食，上述造模方法均能很好地模擬PCOS在卵巢組織形態學及性激素方面的變化[10]。在此基礎上，聯合其他手段使模型大鼠出現顯著的IR及其所致的代謝異常特征，是成功制備出PCOS-IR動物模型的關鍵。目前，有學者[11-12]對此進行了有益的嘗試，主要的方法有：通過皮下注射脫氫表雄酮或者丙酸睪丸油劑聯合高脂飼料喂養的方法構建，模型大鼠盡管出現了典型的PCOS-IR病理及內分泌特征，但外源性雄激素注射的方法，并不適用于進行模型大鼠雄激素變化的研究；通過皮下注射胰島素(insulin,INS)和人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,HCG)的方法[13]，盡管亦構建了均有IR及PCOS 特征的模型，但是并不符合PCOS-IR臨床發病的過程，對于研究大鼠胰島素濃度變化不適用；通過來曲唑聯合高脂飼料飲食21～30 d的方法[14-16]，成功制備了基本符合PCOS-IR 病理及內分泌、代謝紊亂疾病特征的模型，但也存在模型大鼠糖代謝異常及IR程度不高的缺點。

來曲唑作為一種芳香化酶抑制劑，目前被廣泛應用于PCOS模型的制備，其主要機制是通過抑制芳香化酶的生物學作用，減少雄激素向雌激素的轉化，進而降低雌激素濃度，消除其對下丘腦的負反饋抑制，從而使垂體促性腺激素分泌增加，高水平、失去脈沖的LH作用于卵泡膜細胞，生成過多的雄激素，體內雄激素堆積，特別是卵巢局部雄激素增加，導致排卵障礙和卵巢多囊樣改變[17]。盡管來曲唑造模法建立起來的PCOS大鼠模型表現出和人類PCOS類似的代謝特征，但是存在IR狀態不夠典型的弊端。來曲唑聯合高脂飼料的方法，從一定程度上解決了這一弊端，但是模型大鼠的糖代謝異常和IR程度仍不夠明顯。本課題組長期從事胰島素抵抗和2型糖尿病的相關基礎研究，前期通過高糖高脂飼料喂養的方法成功構建了具備顯著IR及糖代謝異常特征的大鼠模型，并經過反復驗證[5-6]。

本研究沿用前期使用的高糖高脂飼料配方和干預時間，聯合連續來曲唑灌胃的方法，嘗試構建PCOS-IR大鼠模型。研究結果顯示，經過28 d的高糖高脂飼料喂養和21 d的來曲唑灌胃后，模型大鼠體質量明顯增加，INS濃度顯著升高，HOMA-IR指數提高3倍以上，同時伴有ISI的顯著下降，空腹FBG濃度亦顯著下降，從而提示模型大鼠出現了顯著的高胰島素血癥及糖代謝紊亂，表現出了顯著的IR特征。動情周期的典型變化為：動情前期，大量有核上皮細胞，偶有少量角化細胞；動情期，鱗片狀無棱角化細胞，或間自少量上皮細胞；動情后期，大量白細胞；動情間期，白細胞為主，有核細胞及無核角化細胞同時存在，以白細胞為主。本研究結果顯示，模型組大鼠血清T濃度出現顯著升高，同時大鼠出現持續的無排卵現象及卵巢組織多囊樣改變，提示模型組大鼠顯現了顯著的IR-高胰島素血癥-高雄激素狀態及典型的PCOS改變。高胰島素血癥可以刺激卵巢合成大量雄激素形成高雄激素血癥，尤其是游離雄激素濃度升高，引起IR的發生。兩者互相促進并形成IR-高胰島素血癥-高雄激素血癥的惡性循環，共同參與卵巢功能障礙的發生，本研究結果與此一致。同時，模型組大鼠血清LH及LH/FSH比值顯著升高，符合典型的PCOS性激素特征。以上研究結果顯示，模型組大鼠體質量顯著增加，出現持續無排卵現象，卵巢組織呈多囊樣改變，同時血清T、LH、LH/FSH比值均顯著升高，此外血清INS和HOMA-IR值顯著升高、IRI指數顯著降低，符合人類PCOS-IR的典型病理改變。

綜上所述，高糖高脂飼料聯合來曲唑連續灌胃的方法可以成功構建具有顯著PCOS-IR病理形態、內分泌異常、代謝紊亂特征的大鼠模型，為未來進行相關后續研究奠定了基礎。