阿爾茨海默病、輕度認知功能障礙及主觀認知下降患者血液DNA中多個基因的甲基化分析

郝淑文 陳 瑛 丁 暉 趙春松,6 梁 闊,6 薛金花,6 蔡彥寧,6*

(1.首都醫科大學宣武醫院神經生物學研究室，北京 100053；2.教育部神經變性病重點實驗室，北京 100053; 3.國家老年疾病臨床醫學研究中心, 北京 100053; 4.首都醫科大學宣武醫院神經內科，北京 100053；5.浙江省臺州市立醫院神經內科, 浙江臺州 318000；6.首都醫科大學宣武醫院生物樣本庫，北京 100053)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD),以記憶和認知功能進行性下降為特征，是最常見的進行性神經退行性疾病[1]。遺忘型輕度認知功能障礙(amnestic mild cognitive impairment, aMCI),以嚴重的情景記憶喪失為特征，通常認為是AD的前驅期(癡呆前期)[2-3]。主觀認知下降(subjective cognitive decline, SCD)，指個體主觀感覺自身認知功能一方面或者多方面持續減退，在AD的持續發展過程中，出現在aMCI之前[4]。SCD的診斷主要基于個體主觀感受的認知能力下降和一組神經心理學測試[1]。因此，需要客觀的SCD生物標志物幫助醫生更容易和可靠地鑒定SCD患者，以便為他們提供早期有效的治療。

DNA甲基化是參與基因表達調控的最重要的表觀遺傳修飾之一。AD腦組織存在DNA甲基化變化，并與AD病理變化密切相關。針對AD和MCI患者外周血的研究[5-12]也表明DNA甲基化變化可以用于疾病的早期預警、診斷及鑒別診斷。D’Addario等[7]的研究顯示，AD患者外周血脂肪酸酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase,FAAH)基因甲基化水平降低；Di Francesco等[8]的研究顯示AD患者外周血花生四烯酸 5-脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase,ALOX5)基因甲基化水平降低；Lunnon等[9]在出現癡呆癥狀前的老年2型糖尿病患者中鑒定了大量CpG位點，包括CBFA2/RUNX1伴侶轉錄共抑制因子3(CBFA2/RUNX1 partner transcriptional co-repressor 3,CBFA2T3)和堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子家族成員E23 (basic helix-loop-helix family member e23,BHLHE23)的上游兩個位點。但是，上述甲基化研究都是在白種人中進行，并未在中國人群進行驗證，并且很少研究SCD患者。因此，筆者設計了該病例對照研究，探索中國人群中可用于SCD客觀診斷的外周血生物標志物。

本研究針對既往報道[7-9]的4種AD和/或aMCI階段DNA甲基化標志物，并且采用亞硫酸氫鹽焦磷酸測序的方法評估其在AD、aMCI、SCD和對照受試者中的甲基化水平。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2015年12月到2017年9月從首都醫科大學宣武醫院神經內科記憶門診招募AD患者31例、aMCI患者41例、SCD患者57例和當地社區健康對照57人為研究對象。本研究得到宣武醫院倫理委員會的批準[臨研審(2014)011號]，符合世界醫學協會道德守則(赫爾辛基宣言)的規定，每位研究對象獲得知情同意。

AD患者滿足美國國立神經病、語言功能紊亂和腦卒中研究所及AD和相關疾病協會 (National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association, NINCDS-ADRDA)可能癡呆的臨床診斷標準[13]。aMCI患者根據Petersen標準[14]進行診斷。SCD患者滿足最近提出的SCD診斷標準[4]。健康對照無記憶和智能障礙，并且其臨床癡呆評估量表(Clinical Dementia Rating, CDR)評分為0。如果受試者有以下一個或多個臨床特征將排除：①明確的卒中史;②嚴重抑郁[漢密爾頓抑郁量表評分(Hamilton Depression Rating Scale, HAMD)>24分];③由創傷性腦外傷導致認知受損;④其他和認知受損相關的神經系統疾病，例如腦腫瘤、帕金森病、腦炎和癲癇;⑤其他可以導致認知受損的系統疾病，例如甲狀腺功能障礙、嚴重貧血、梅毒和艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS);⑥精神病史或者先天性智力發育遲緩。所有參與者都進行了簡易精神狀態量表(Mini-Mental State Examination,MMSE)評估。

1.2 研究方法

1.2.1 甲基化候選基因的挑選

ALOX5和FAAH基因甲基化水平的失調，其轉錄和翻譯水平也失調[7-8]，此外，在出現癡呆癥狀前的老年2型糖尿病患者中鑒定了大量CpG位點，包括CBFA2T3和BHLHE23基因上游兩個位點[9]。因此本研究中共檢驗了4個候選基因：FAAH、ALOX5、CBFA2T3和BHLHE23。

1.2.2 焦磷酸測序分析

早晨6:00到8:00收集靜脈血樣。QIAamp DNA mini 試劑盒(德國Qiagen公司)抽提白細胞基因組DNA,并進行亞硫酸氫鈉處理[15]。對于亞硫酸氫鹽反應(其中胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶保持不變)，基因組DNA的最初變性使用0.3 mol/L NaOH，再加入偏亞硫酸氫鈉(pH 5.0)和對苯二酚使終濃度分別為3.0 mol/L和0.5 mmol/L。反應混合物上加礦物油，避光，于50 ℃孵育16 h。變性的DNA用Wizard DNA純化試劑盒純化(美國Promega公司)，后用0.3 mol/L NaOH 在37 ℃處理15 min終止反應，乙醇沉淀。對于亞硫酸氫鹽焦磷酸測序分析，50 ng亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA應用HS Taq(日本Takara公司)進行擴增。4個靶基因的聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增引物及測序引物的序列如表1所示。CBFA2T3的上游引物在5′端包含生物素，而其他三個基因的下游引物在5′端包含生物素。ALOX5的擴增條件如下:94 ℃預變性 2 min;94 ℃變性20 s,61 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共50個循環，最后72 ℃延伸5 min。FAAH、CBFA2T3和BHLHE23的擴增條件如下： 94 ℃預變性2 min;94 ℃ 變性20 s,64 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共50循環，最后72 ℃延伸5 min。對于焦磷酸測序反應，使用PSQ真空預處理裝置(德國Qiagen公司)將單鏈DNA模板固定在鏈霉親和素標記的Sepharose高性能微珠(瑞典GE Healthcare公司) 上。反應物在80 ℃孵育2 min，冷卻至室溫，使用0.4 mmol/L測序引物，使用Pyromark Q96 焦磷酸測序儀和測序試劑盒(德國Qiagen公司)，按照儀器和試劑盒說明書進行焦磷酸測序。

表1 用于定量4個不同基因甲基化水平的焦磷酸測序分析的引物

1.2.3 基因分型

載脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE)ε2/ε3/ε4單倍型的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNPs) rs7412 和 rs429358。使用標準Sanger測序方法對APOE進行基因分型，使用引物如下：5′-ACGCGGGCACGGCTGTCCAAGG-3′(上游)和5′-GGCGCTCGCGGATGGCGCTGA-3′(下游)。APOE擴增條件如下：98 ℃ 10 s；72 ℃ 5 s，共35循環，72 ℃ 5 min。PCR在終體積30 μL的溶液中進行，包含10 pmol上游和下游引物，50 ng基因組DNA模板，并使用有GC緩沖液的PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 (日本Takara公司)。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組研究對象的基本特征

4組間性別構成差異無統計學意義(P>0.05)。 AD組患者年齡大于aMCI、SCD、對照組，MMSE評分低于其他組，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。APOEε4等位基因的攜帶者頻率AD組最高，其次是aMCI組，健康對照組最低，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 研究對象的基本特征

2.2 各組FAAH, ALOX5, CBFA2T3和BHLHE23基因甲基化水平比較

4個基因的甲基化水平在各組間差異均無統計學意義(P>0.05)，詳見表3。根據性別的分層分析，男性中FAAH:P=0.234,ALOX5:P=0.865,CBFA2T3:P=0.109,BHLHE23:P=0.502;女性中FAAH:P=0.337,ALOX5:P=0.250,CBFA2T3:P=0.624,BHLHE23:P=0.355，分層后各組間4個基因的甲基化水平差異均無統計學意義。根據APOE基因型分層分析，APOEε4非攜帶者中FAAH:P=0.293,ALOX5:P=0.335,CBFA2T3:P=0.364,BHLHE23:P=0.395；APOEε4攜帶者中FAAH:P=0.347,ALOX5:P=0.908,CBFA2T3:P=0.898,BHLHE23:P=0.704，分層后各組間4個基因的甲基化水平差異均無統計學意義。

表3 AD, aMCI, SCD和對照組血液DNA中4個靶基因的甲基化水平

3 討論

由于SCD的診斷主要依靠患者主觀感覺認知能力下降和神經心理學測試，缺乏客觀的診斷生物標志物，早期診斷對于患者治療具有重要意義。因此，在本研究中筆者假設AD和/或aMCI的診斷生物標志物可能也有潛力作為SCD的生物標志物。為了檢測這一假設，挑選了4個之前報道[7-9]的AD和/或aMCI差異甲基化的基因，并評估了它們在AD、aMCI、SCD和對照受試者中的甲基化水平。發現4個候選基因中沒有一個在SCD患者中是差異甲基化的。這表明在AD的晚期或中期鑒定的DNA甲基化變化不總是適用于SCD的生物標志物。

FAAH是終止內源性大麻素信號轉導的酶之一，它能夠水解花生四烯酸乙醇胺(arachidonic acid ethanolamine, AEA)和其他脂肪酸酰胺。FAAH參與AD的炎性反應過程及花生四烯酸等促炎分子的釋放[16]。5-脂氧合酶(5-lipoxygenase, 5-LOX)是花生四烯酸生成白三烯類介質(leukotrienes, LTs)的限速酶，由5-LOX合成的白三烯參與和年齡相關癡呆及神經退行性疾病的大腦炎性反應[17-18]。盡管CBFA2T3和BHLHE23與癡呆相關聯的可能機制尚無報道，但是Lunnon等[9]的研究顯示其甲基化在AD中發生改變，其差異甲基化可能成為早期認知改變的潛在生物標志物。

本研究選取的4個基因分析甲基化水平，其甲基化值分布在較低(FAAH、ALOX5:<10%)、中等(CBFA2T3: 20%～30%)和較高(BHLHE23: 80%～90%)，這種設計可對AD、MCI及SCD人群的甲基化研究有比較全面的了解，從不同的基因、不同的甲基化水平探討可能的疾病生物標志物。

本研究未在AD和/或aMCI患者與正常對照之間檢驗出有統計學意義的甲基化，可能有以下原因。首先，應該注意到FAAH、ALOX5、CBFA2T3和BHLHE23的差異甲基化在白種人中鑒定，而本研究中招募的受試者是中國人。種族的差異可能會導致不一致的研究結果。實際上，已經有研究[19]顯示伴神經母細胞瘤的德國和日本患者之間同源盒A9(homeobox A9，HOXA9)基因啟動子甲基化水平的差異。此外，在印度亞洲人之間代表4個位點甲基化狀態的甲基化評分顯著高于歐洲人[20]。這些研究結果表明當選擇潛在的甲基化生物標志物用于驗證時，應該考慮種族的差異。其次，之前FAAH及ALOX5基因的研究[7-9]中采用外周血單核細胞，本研究中采用外周血白細胞。從全血中提取的DNA甲基化由不同類型血液有核細胞混合的DNA甲基化構成[21]。全血DNA甲基化研究[22]中不同血細胞類型分布可能作為混雜因素。本研究使用全血DNA，血細胞類型不確定的構成可能潛在影響結果。另外，之前的CBFA2T3和BHLHE23研究受試者是出現癡呆癥狀前的老年2型糖尿病患者。2型糖尿病本身和AD密切相關[23]，其差異甲基化位點可能在一定程度上受到基礎疾病的影響。最后，還有甲基化檢測方法不一致，本研究中采用亞硫酸氫鹽焦磷酸測序，而焦磷酸測序是甲基化定量研究的金標準。之前FAAH的研究[7]采用甲基化特異性引物實時PCR，ALOX5研究[8]采用基于熒光的實時PCR、CBFA2T3和BHLHE23的研究采用Illumina人甲基化450 K基因芯片技術。這些條件的不一致可能是本研究和既往研究結果不同的原因。

雖然本研究并未發現4個基因甲基化水平的差異，但是，這些結果并不能排除一些人群中的AD關鍵特異性基因的甲基化改變，當前的結果應謹慎解釋，有必要在更大的病例對照人群中進行該領域的研究，進一步確定DNA甲基化在神經退行性疾病中的程度和作用。本研究使用焦磷酸測序技術在中國AD患者中進行FAAH、ALOX5、CBFA2T3、BHLHE23基因甲基化的研究，為神經退行性疾病的早期診斷和治療提供了一定的理論依據。

總之，本研究表明與健康對照相比，FAAH、ALOX5、CBFA2T3和BHLHE23四個基因在AD、aMCI或者SCD患者中未發現差異甲基化。在AD的晚期或中期鑒定的DNA甲基化變化不總是適用于SCD診斷的生物標志物。