基于網絡藥理學探討丹參治療妊娠期高血壓的作用機制*

曹煥澤，胡亦然，任玲，蔡平平

1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250000；2.山東第一醫科大學附屬省立醫院，山東 濟南 250000

妊娠期高血壓（hypertensive disorders of pregnancy，HDP）是以高血壓、蛋白尿為主要臨床表現的妊娠期特發疾病，嚴重者伴發多臟器損傷，甚至導致死亡［1］。HDP是導致孕產婦和新生兒死亡的主要原因之一，死亡率占全球孕婦總死亡率的14%，與正常孕產婦相比，妊娠期高血壓患者心、腦血管等遠期并發癥發生率有所增加［2-3］。近年來常在基礎治療的基礎上聯合中藥注射液治療妊娠期高血壓的臨床對照研究，選用的中藥注射液以丹參制劑——丹參注射液與復方丹參注射液最為常見，并且有較好的治療效果。丹參，是婦科常用藥之一，有“女科要藥”之稱，其最早記載見于《神農本草經》，早在北宋時期已有丹參用于“妊娠中風”的記載。藥理研究表明，丹參具有抗腫瘤、保護血管內皮、抗炎、抗氧化、抗抑郁、改善糖代謝等作用［4-5］。但是丹參活性成分多，作用靶點繁雜，其在妊娠期高血壓治療中的機制仍待進一步明確。

本文從網絡藥理學為角度，探討丹參治療妊娠期高血壓的有效成分以潛在作用靶點，并探索其可能的作用機制，為臨床用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 丹參主要活性成分及潛在作用靶點篩選基于中藥系統藥理數據庫和分析平臺（TCMSP），以“丹參”（danshen）為關鍵詞，生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選條件檢索，獲得丹參主要活性成分及作用靶點。

1.2 妊娠期高血壓的相關靶基因檢索應用Genecards數據庫（https：//www.genecards.org/）以“hypertensive disorders of pregnancy”為關鍵詞檢索，獲取HDP的所有相關基因，保留Score≥10的結果。同時在OMIM數據庫（https：//omim.org/）中，以“hypertensive disorders of pregnancy”為關鍵詞檢索，獲取相關基因。將兩數據庫中獲得的基因進行合并、去重以及規范基因名稱等處理。

1.3 構建“疾病-藥物-活性成分-靶點”網絡圖將丹參主要活性成分的靶基因與妊娠期高血壓相關靶基因進行映射，利用韋恩圖（Venn）將兩者取交集，得到丹參-妊娠期高血壓的藥物-疾病交集基因。將交集基因及丹參主要活性成分定義為網絡圖的節點，藥物、疾病、藥物——疾病交集靶點基因以及藥物活性成分間相互作用關系定義為網絡圖的連接，運用Cytoscape軟件，構建丹參治療HDP的“疾病-藥物-活性成分-作用靶點”網絡圖。

1.4 藥物-疾病靶點蛋白互作網絡（PPI）的構建將藥物-疾病交集靶點基因，作為“Ptotein Name”輸入STRING數據庫（https：//string-db.org/），物種設定為“Homo sapiens”，結合分數設定為＞0.4，忽略孤立節點，構建丹參-妊娠期高血壓的靶點蛋白互作網絡。

1.5 GO生物過程及KEGG信號通路分析采用Uniprot數據庫，將藥物-疾病交集基因名稱轉化Uniprot ID。運用Bioconductor數據工具平臺（http：//www.bioconductor.org/）與Rx64（3.6.3）軟件，分析靶點的GO富集和KEGG信號通路，并將所得結果可視化。

2 結果

2.1 丹參主要活性成分與相關分子靶基因通過TCMSP數據庫搜索“丹參”，檢索到202種化合物。以OB≥30%和DL≥0.18為條件進行篩選，得到丹參主要活性成分65種，對應靶基因108個。

2.2 妊娠期高血壓相關基因以“hypertensive disorders of pregnancy”為關鍵詞進行檢索，于Genecards數據庫獲取HDP相關基因4706種，設定相關度≥10%為篩選條件，二次篩選后收集到基因1 573個；于OMIM數據庫中檢索到HDP相關基因735個。將兩數據庫獲得的相關基因匯總、刪除重復基因，共1 945個HPD相關基因，作為疾病靶基因。

2.3 “疾病-藥物-活性成分-作用靶點”網絡將丹參對應的108個靶點基因與1945個疾病靶基因進行映射，通過Venn圖分析得到丹參-HDP相交靶基因共73個。將節點及節點間相互作用的數據導入到Cytoscape軟件，得到丹參治療HDP的“疾病-藥物-活性成分-作用靶點”網絡圖，見圖1，其中靶點基因中PTGS2、SCN5A、ADRB2、OPRM1、ADRA1A、ACHE度值較高，丹參活性成分中度值較高的為luteolin、tanshinone iia、4-methylenemiltirone、salviolone、dihydrotanshinlactone。

圖1 “疾病-藥物-活性成分-作用靶點”網絡圖

2.4 藥物-疾病靶點蛋白互作網絡（PPI）將73個丹參-HDP交集基因導入STRING數據庫進行蛋白相互作用網絡分析，見圖2，PPI網絡中蛋白節點73個，764條相互作用線，平均節點度20.9，平均局部聚類系數為0.7。根據PPI中基因之間連接節點數目，統計出連接節點最多的30個核心靶點，見圖3。其中AKT激酶（AKT1）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）為連接節點最多的4個靶點，連接節點數目分別為43、40、39、38個。

圖2 藥物-疾病靶點蛋白互作網絡圖

圖3 藥物-疾病核心靶點

2.5 GO富集功能分析GO富集分析獲得109個生物過程，排名前10的分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC），見圖4。MF以兒茶酚胺、磷酸酶、類固醇、細胞因子受體結合及G蛋白偶聯胺受體、腎上腺素能受體、核受體、轉錄因子、類固醇激素受體活化為主；血管的大小、管徑、收縮及循環系統中血管的調節，對類固醇激素、抗生素、異生物質、金屬離子的應激反應、肌細胞增殖、腺體發育是主要BP。CC相關度高的為細胞膜、膜質微區、膜區域，突觸前膜、突觸后膜、突觸膜的組成部分及固有成分等。

圖4 GO富集功能分析

2.6 KEGG通路富集分析KEGG通路富集到44條相關通路，篩選出富集程度最高的20條通路，見圖5。其中信號傳導通路在相關通路中占據較大比重，涉及PI3K/AKT信號通路、HIF-1信號通路、VEGF信號通路、TNF信號通路、FOxO信號轉導通路、MAPK信號通路、JAK-STAT信號通路等。其中PI3K/AKT信號通路，見圖6，涉及CHRM2、EGFR、AKT1、VEGFA、CCND1、CDKN1A、CASP9、MAPK1、IL6、MDM2、ERBB2、IL2、IL4、INSR、MET、BCL2、MYC、ITGB3等18個相關基因，基因富集程度最高。

圖5 KEGG富集程度最高的20條通路

圖6 PI3K/AKT信號通路

3 討論

本文運用網絡藥理學的方法對丹參治療妊娠期高血壓的相關活性成分、作用靶點以及途徑進行分析。丹參活性成分多，經過篩選后，生物利用度與類藥性較高的丹參活性成分達65種，丹參酮、隱丹參酮、木犀草素、4-亞甲基硝胺以及二氫丹參內酯度值較高，可能在治療妊娠期高血壓中發揮更關鍵作用。

丹參治療HDP潛在靶點的PPI網絡分析顯示，AKT激酶（AKT1）、IL-6、血管內皮生長因子A（VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）等靶點相互作用蛋白眾多，可能為關鍵靶點。AKT作為多種信號通路的中心節點，參與代謝，細胞增殖、存活、生長，血管生成的調節等過程的信號傳導［6］。VEGF具有血管擴張的作用，可誘導一氧化氮的產生，通過調節血管活性功能和血管生成反應，參與胎盤發育和功能所需的新血管的形成［7］。胎盤受損的螺旋動脈重塑導致抗血管生成因子釋放，誘發母體血管內系統性炎癥反應和內皮功能障礙是導致妊娠期出現高血壓和蛋白尿［8］。IL-6可與體內其他炎性因子相互作用，令血管收縮與血壓升高，導致子癇等一系列的臨床表現［9］。MAPK是絲裂原活化蛋白激酶信號轉導通路的重要組成部分，參與內皮細胞炎性反應和炎性因子表達信號通路的轉導。PPI網絡中顯示了與血管及內皮生成、炎癥反應相關的一系列靶點，如表皮生長因子受體PP1、NOS2、IL10、IL4、IL2、IFNG、CD40配體等；與細胞凋亡及離子通道調節相關的蛋白，如Bcl-2、E3泛素蛋白連接酶等。

靶點的富集分析顯示丹參治療HDP的作用涉及多個生物過程及信號通路，如PI3K/AKT信號通路、HIF-1信號通路、VEGF信號通路、TNF信號通路、表皮生長因子受體、FOxO信號轉導通路、MAPK信號通路、JAK-STAT信號通路等。胎盤螺旋小動脈重鑄不足、胎盤持續缺氧是先兆子癇發病機制之一，低氧胎盤釋放出抗血管生成和促炎因子，引起母體血管內皮功能障礙、高血壓和器官損傷［10］。PI3K/AKT信號通路存在廣泛，參與細胞生長、增殖及分化與遷移的調節，介導sFlt-1等血管內皮生長因子拮抗劑蛋白的激活，調節血管生成因子的血漿水平與血管介質，通過調節滋養層細胞的侵襲，維持胎盤功能；同時可激活下游eNOS，促進NO釋放，調控血管舒張，增加胎盤血供［11-13］。曹慧敏等［14］發現，丹參酮II A通過調控PI3K/Akt信號通路減輕氧化應激導致的內皮細胞損傷。缺氧誘導因子信號通路（HIF-1信號通路）參與氧化應激反應，通過激活下游相關靶點減輕耗氧量，并調控Bac-2以調節細胞凋亡。缺氧誘導因子（HIF-1）是HIF-1信號通路中的關鍵因子，在機體處于低氧狀態時激活HIF-1信號通路參與氧化應激反應，調節機體各組織功能，減輕耗氧量，適應缺氧狀態［15］。HIF-1信號通路過度活化，胎盤對氧敏感性增加，滋養細胞的浸潤能力下降，是導致妊娠期高血壓的機制之一［16］。JAK/STAT信號通路可作用于細胞生長和分化及免疫等，與內皮細胞功能障礙相關，抑制此通路可改善血管內皮的分泌功能以及eNOS高表達，阻止子癇前期的重要危險因素sFlt-1的產生［17-18］。表皮生長因子通路（EGF信號通路）調節滋養細胞的分化，其破壞可能導致發生妊娠期高血壓［19］。炎性過程與妊娠期高血壓的發病相關，患有妊娠并發癥的婦女血清中TNF-α，IL-6，IL-10等炎性因子升高［20-21］。TNF信號通路可調控IL-6與NF-κB表達，調節eNOS，控制血管炎癥，同時可調節氧化應激反應，改善胎盤血管循環障礙［22-23］。FOXO是絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT（也稱為蛋白激酶B）的主要底物，PI3K/Akt途徑的激活拮抗FOXO活性，又能夠擴增信號傳導［24］。

綜上所述，本文通過網絡藥理學的方法對丹參在治療妊娠期高血壓中潛在作用機制進行探究，認為丹參治療妊娠期高血壓的相關靶點多集中在AKAKT1、IL-6、VEGFA、MAPK1等靶點，調控PI3K/AKT信號通路、HIF-1信號通路、VEGF信號通路、TNF信號通路、表皮生長因子受體、FOxO信號轉導通路、MAPK信號通路、JAK-STAT信號通路等多條通路，影響胎盤螺旋動脈收縮、保護血管內皮細胞、調節機體炎癥反應與氧化應激。但是網絡藥理學僅是單純從化學成分、作用靶點、信號通路方面進行的理論篩選，后續仍需更多實驗數據進行支持以及驗證。