基于網絡藥理學三葉湯治療病毒性肺炎作用機制探討

謝嘉嘉，張立

深圳市寶安中醫院，廣東 深圳 518100

病毒性肺炎是由上呼吸道出現病毒感染，病原體向下發展所致的肺部炎癥，主要特征是干咳、咳痰、發熱、氣喘、肺部濕性啰音等。致病菌包括呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、巨細胞病毒等，最為常見的是呼吸道合胞病毒［1］。

病毒性肺炎在中醫學上屬于“風溫肺熱”“疫病”“肺炎咳嗽”之類，其病機為邪熱郁于肺，病位在肺，主要癥狀為咳、痰、熱、喘［2］。若身體虧虛，正衰邪盛，易出現邪毒內陷、復感他邪、正氣虛衰等［3］，故病情變化甚快，需要盡早干預。2019年的新型冠狀病毒肺炎，同樣是病毒性肺炎的一種，其感染病原體是β屬冠狀病毒，主要經呼吸道飛沫、氣溶膠或密切接觸傳播，臨床表現是發熱、干咳、乏力等，發病早期會出現白細胞數正常或減少，淋巴細胞數正常或減少；新型冠狀病毒核酸檢測陽性或特異性抗體異常；胸部影像學出現以肺外帶為主的多發斑片影或間質改變。新型冠狀病毒肺炎屬中醫“疫病”相關范疇，即感受了“疫戾”之氣發而為病，此次疫情中醫藥發揮了獨特的優勢［4］。中醫藥是以整體觀念為本，通過辨證論治，針對具體病情調整用藥，治療疾病時具有顯著的特色、療效及優勢［5］。

經嶺南各代醫家在止嗽散的基礎上辨證加減而擬方的三葉湯［6］，主要遵循“疏風清熱、潤肺止咳”的治法，本研究的三葉湯是由廣州中醫藥大學第一附屬醫院劉小虹教授根據臨床經驗進行藥物加減而成，共12味中藥，人參葉、龍脷葉、枇杷葉、浙貝母、苦杏仁、桔梗、牛蒡子、防風、木蝴蝶、甘草、紫菀、款冬花。方中以人參葉、龍脷葉、枇杷葉三藥共用為君，人參葉性寒，味苦、甘，歸肺、胃經，可祛暑生津、補氣益肺；枇杷葉，性味苦、微辛微寒，入肺、胃經，可清肺止咳、和胃降逆；龍脷葉是嶺南的道地藥材，性平，味甘、淡，歸肺、胃經，可潤肺止咳、通便；三者均可入肺經，清潤上焦肺氣。苦杏仁，苦降，止咳化痰、降逆平喘，為臣藥；桔梗，辛散，開宣肺氣，同杏仁合用，使肺得以宣降，故能止咳；防風為風中之潤藥，辛能散肝，香能舒脾，風能勝濕，走表而散風御邪；浙貝母，化痰止咳、清熱散結，助杏仁止咳化痰；木蝴蝶，可清肺利咽和胃、疏肝。紫菀，苦、辛、甘、微溫，歸肺經，潤肺化痰止咳；款冬花，化痰降氣平喘，與紫菀相須為用，紫菀善于化痰，款冬花善于止咳，兩者常配伍用。牛蒡子，辛涼，解毒利咽、疏散風熱、清利頭目；甘草調和諸藥。全方共奏疏風宣肺、潤肺止咳之功效，且在長期實踐中證實該方有止嗽的療效，被證實可用于治療鼻后滴流綜合征之慢性咳嗽、上氣道咳嗽綜合征、感染后咳嗽、咳嗽變異性哮喘等［7-9］。

網絡藥理學是基于系統生物學基礎，對生物系統和疾病的網絡聚類分析，選擇特有的數據信號節點進行多靶點藥物分子結構設計，進行綜合分析的新學科。其基本原理是通過分析有效成分、基因、蛋白質、信號通路，建立網絡模型及數據可視化，系統地展示中藥、方劑藥理作用及機制［10］。目前已被廣泛應用于中藥的基本藥效、藥效相關性及中藥復方作用機制等［11］，可提高藥物的治療效果，減少藥物不良反應，提高新型藥物臨床研究的成功率。

本研究運用網絡藥理學方法篩選了三葉湯的活性化合物和作用的靶點，并進行系統聚類分析，建立藥物-化合物-靶點系統網絡，同時分析信號通路，為三葉湯更廣泛地應用于治療病毒性肺炎提供理論依據。

1 方法

1.1 三葉湯所含藥物的化合物收集和篩選應用中藥系統藥理學分析平臺數據庫（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）及Batman-TCM數據庫以“人參葉”“枇杷葉”“龍脷葉”“苦杏仁”“浙貝母”“桔梗”“牛蒡子”“防風”“木蝴蝶”“紫菀”“甘草”“款冬花”為關鍵詞進行分析，檢索三葉湯中各藥物的化合物成分。根據毒藥動力學原理，口服生物利用度（oral bioavailability，OB），即制劑中藥物被吸收進入人體循環的速度及程度，該數值越高表明該藥物的生物活性分子類藥性（durg-likeness，DL）則越好［12］。結合相關文獻報道，借助TCMSP平臺，以OB≥30%及DL≥0.18為基準，檢索人參葉、枇杷葉、龍脷葉、苦杏仁、浙貝母、桔梗、牛蒡子、防風、木蝴蝶、甘草、紫菀、款冬花所含化合物，篩選出符合標準的活性成分。

1.2 篩選靶標蛋白及構建藥物-化合物-靶點網絡運用TCMSP平臺，對三葉湯中篩查出的活性成分進行檢索，查找與之對應的目標蛋白，使用Unpirot數據庫（http：//www.uniprot.org/）查詢靶標蛋白對應的基因，合并重復的靶點并刪除無對應基因的蛋白。采用Cytoscape 3.7.2軟件分析化合物及建立靶點網絡。

1.3 預測三葉湯治療病毒性肺炎的潛在作用靶點使用疾病靶點數據庫（Genecards http：//www.genecards.org/）以“viral pneumonia”為關鍵詞檢索和病毒性肺炎相關聯的疾病基因。將篩選得到的疾病靶點與藥物靶點進行映射，從而選取三葉湯在治療病毒性肺炎中的潛在作用靶點。

1.4 構建及分析PPI網絡將以上步驟篩選得到的潛在作用靶點導入STRING數據庫（https：//stringdb.org/），并設定物種為“Homo Sapiens”，從而獲得蛋白與蛋白之間相互作用關系圖，保存為TSV格式文件，將文件導入到Cytoscape3.7.2軟件中，使用“network analyzer”功能分析其網絡拓撲屬性，篩選出核心靶點。

1.5 分析靶點通路為更好地了解所篩選出的三葉湯治療病毒性肺炎的潛在作用靶點基因的功能及在信號通路中的作用，將靶基因導入Funrich 3.1.3軟件，進行GO富集分析。GO富集分析分別選用生物過程（biological processes，BP），細胞功能（molecular function，MF），細胞組分（cell composition，CC），依其富集靶點數目排序，導出前10個條目的條形圖。最后，把選出的靶基因導入STRING數據庫（https：//string-db.org/），分析KEGG信號通路富集，通過Omicshare云平臺（http：//omicshare.com/）的繪圖工具繪制氣泡圖，使數據可視化。

2 結果

2.1 篩選三葉湯中活性化合物運用TCMSP數據庫檢索并篩選出三葉湯所含的化合物，以OB≥30%且DL≥0.18的基準，篩得三葉湯共含有活性化合物共239個，其中9個來自人參葉，18個來自枇杷葉，2個來自龍脷葉，19個來自苦杏仁，7個來自浙貝母，7個來自桔梗，8個來自牛蒡子，18個來自防風，18個來自木蝴蝶，92個來自甘草，19個來自紫菀，22個來自款冬花。表1為三葉湯中部分活性化合物的基本信息。

2.2 構建及分析藥物-化合物-靶點網絡運用Cytoscape 3.7.2軟件構建三葉湯中藥物-活性化合物-靶點相互作用網絡圖，見圖1。該網絡共有240個節點，包括1個疾病名稱節點、1個藥物名稱節點、28個活性化合物節點和210個靶點節點，共2 886條邊。網絡中菱形代表病毒性肺炎，三角形代表三葉湯中的藥物，中間的長方形代表活性化合物，外周的圓形代表靶點基因。網絡中的每條邊代表藥物所含有的活性化合物、活性化合物與靶點基因之間的相互作用關系。等級值及中心度值是衡量節點在網絡中關鍵性的重要指標，故選取等級值與中心度值較大的節點，這些節點在網絡中起到了重要樞紐作用，可能是關鍵化合物或靶點。分析所得排名前6位的活性化合物為MOL000098-槲皮素、MOL00682-表沒食子兒茶素沒食子酸酯、MOL000006-木樨草素、MOL000422-山奈酚、MOL000173-漢黃芩素、MOL004328-柚皮素，分別能與108、89、46、32、26、25個靶點蛋白發生作用。靶點方面，共有7個能與21個或21個以上的化合物相互作用，排名前6位的是CASP3、BCL2、PTGS2、BAX、RELA、JUN，分別能與28、26、24、23、23、23個活性化合物相互作用。

2.3 三葉湯治療病毒性肺炎潛在作用靶點的預測通過GeneCards數據庫檢索共有3263個病毒性肺炎的潛在靶點。運用Omicshare云平臺繪制Venn圖，將三葉湯活性成分調控的靶點與病毒性肺炎的潛在靶點進行映射獲取交集，共獲得210個交叉靶點作為三葉湯治療病毒性肺炎的潛在作用靶點，見圖2。

圖1 藥物-有效成分-靶點網絡圖

2.4 PPI網絡構建與分析PPI網絡圖中包含210個節點，340條邊，見圖3。靶點蛋白平均節點度值為3.24，其中度值大于4的靶蛋白有30個，說明三葉湯發揮藥理作用的關鍵靶點極可能是這30個靶蛋白，見圖4。從圖中可看出各個蛋白互聯關系網絡中，排在前5位的分別是STAT3、JUN、AKT1、IL-6、VEGFA，提示這幾個靶蛋白在三葉湯治療病毒性肺炎中起到重要的作用。

表1 三葉湯中部分活性化合物的基本信息

圖2 三葉湯治療病毒性肺炎潛在靶點Venn圖

圖3 三葉湯“蛋白質-蛋白質”相互作用（PPI）網絡圖

2.5 靶點GO富集分析和KEGG通路分析將210個三葉湯治療病毒性肺炎的潛在靶點基因輸入到FunRich 3.1.3軟件中，得到242個GO富集條目，見圖5，包括23個BP、58個MF和161個CC。BP主要富集在信號傳導、能量轉換途徑、蛋白代謝、細胞凋亡、細胞間通信、新陳代謝、核堿基監測、免疫應答、傳輸、細胞生長和（或）維持；MF主要富集在轉錄因子活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、催化活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、金屬肽酶活性、細胞因子活性、細胞黏附分子活性、轉換活性、氧化還原酶活性、受體信號復合體支架；CC主要富集在細胞質、細胞核、細胞質膜、細胞外基質、外泌體、細胞液、細胞外空隙、溶酶體、內質網、線粒體。KEGG通路富集分析篩選得到171條（P＜0.05）信號通路，主要涉及PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、人巨細胞感染通路（Human cytomegalovirus infection）、卡波西肉瘤皰疹病毒相關感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、糖尿病并發癥的年齡信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、丙型肝炎（Hepatitis C）、乙型肝炎（Hepatitis B）等。選取前20條富集基因通路所繪制的氣泡圖，見圖6，其中Y軸代表通路名稱，X軸代表所占百分比，氣泡面積代表通路富集基因數。根據蛋白靶點與信號通路之間的關系，選取關鍵通路，建立“靶點-通路”網絡圖，見圖7。

圖4 三葉湯治療病毒性肺炎的關鍵靶蛋白信息

圖5 GO富集功能分析圖

圖6 三葉湯治療病毒性肺炎KEGG通路富集氣泡圖

圖7 靶點-通路網絡圖

3 討論

病毒性肺炎是由病毒感染引起的急性呼吸系統疾病。最常見的可引肺炎的呼吸道病毒有腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、鼻病毒、冠狀病毒等［13］。病毒性肺炎屬“疫病”范疇，其主要病機是人體正氣和外感病邪之間的消長變化，就如“正氣存內，邪不可干”的關系。人的正氣受到先天稟賦與后天臟腑氣血調養狀態的影響，當人體正氣的某一方有所偏頗，病邪性質和正氣偏頗相切合時易發病［14］。嶺南地區氣候炎熱，久居易陽熱偏盛，熱盛則汗泄而氣陰不足；嶺南常年濕氣彌漫氤氳，濕熱蘊結于內可致脾胃失健運，出現納呆、腹脹、便秘，故嶺南人常居此地則易致溫病，以暑濕、濕熱為主［15］。三葉湯中龍脷葉為嶺南道地藥材，其歸肺、胃經，潤肺止咳、通便，常用于肺燥咳嗽。此外在疏風清熱的基礎上兼顧濕邪的治療。三葉湯由經典名方“止嗽散”加減組成，具有疏風清熱、宣肺止咳之功效。文獻報道通過三葉湯治療肺型感染咳嗽且效果明顯［16］。

本研究運用網絡藥理學方法共篩選出三葉湯中239個化合物，286個作用靶點，210個三葉湯治療病毒性肺炎潛在靶點，表明三葉湯治療病毒性肺炎的多成分、多靶點特征。從“藥物-活性化合物-靶點”相互網絡中篩查出關鍵活性化合物，根據中心度值和等級值排序得出前5名的有效成分為槲皮素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、山奈酚、木樨草素、漢黃芩素。提示槲皮素相互作用的靶點數共108個，說明槲皮素發揮的作用可能最為顯著。槲皮素已被證實具有抗病毒、祛痰止咳、抗菌、免疫調節、抗腫瘤、抗氧化等作用［17］。曹念等［18］認為表沒食子兒茶素沒食子酸酯可抑制炎癥、脂質過氧化，清除氧自由基，從而減輕肺缺血再灌注損傷。沒食子兒茶素沒食子酸酯被證實可抗流感，主要是通過作用流感病毒血凝素，抑制RNA聚合酶，降低神經氨酸酶活性，具有多途徑、多位點抗流感的良效［19］。木樨草素能促進IκB-α的表達，對急性肺損傷有保護作用［20］。研究表明，山奈酚可抗病毒、抗菌、抗炎、增強機體免疫、抗氧化［21］；漢黃芩素可顯著抑制NF-κB信號通路，對急性肺損傷小鼠有保護作用［22］。

對三葉湯治療病毒性肺炎PPI網絡進行分析，共有210個靶點蛋白，網絡拓撲分析發現，白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、STAT3、JUN、AKT1是三葉湯治療病毒性肺炎的主要作用靶點。STAT3是一種能與DNA結合的蛋白質，在轉錄激活、信號轉導方面發揮了關鍵性的作用。急性肺損傷時，JAKs-STAT3通路會被激活，而IL-6則能活化STAT3通路，從而保護肺；此外STAT3通路的激活，對抗凋亡有一定的作用［23］。JUN基因是禽肉瘤病毒17的轉化基因，其編碼的蛋白與病毒蛋白高度相似，能直接與特定的靶DNA序列作用，達到調節基因的作用。研究表明，JUN可參與肺損傷的修復過程［24］。AKT1是PI3K/Akt信號轉導通路的關鍵分子，多種疾病如癌癥、糖尿病常伴隨Akt1調控的紊亂［25］。病毒感染、雙鏈RNA可誘導正常細胞產生IL-6，參與免疫應答的細胞增殖分化，改善其功能。肺組織損傷時IL-6會參與到T細胞介導的免疫反應，參與肺部損傷、免疫損傷過程［26］。

從三葉湯治療病毒性肺炎的靶點GO富集分析可看出，其生物過程主要涉及細胞間通信、細胞凋亡、新陳代謝、蛋白代謝、免疫應答等，這些生物過程在三葉湯治療病毒性肺炎中起到了較為關鍵的作用。KEGG通路富集分析篩選得到171條信號通路，主要涉及PI3K-Akt、甲型流感病毒、人巨細胞感染通路、卡波西肉瘤皰疹病毒相關感染、EB病毒（epsteinBarr virus，EBV）、麻疹病毒、腫瘤壞死因子、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥等。研究證明，PI3K-Akt是病毒的一個重要靶標，該信號通路與細胞增殖、轉錄翻譯、細胞凋亡等進程有著密切的聯系，諸如埃博拉病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒、流感病毒、人巨細胞病毒、柯薩奇病毒的感染，可通過阻斷PI3K-Akt信號通路，達到抑制病毒之作用［27］。

本研究借助網絡藥理學的方法證實三葉湯治療病毒性肺炎的多成分、多靶點、多途徑的特點，可為三葉湯的拓展臨床應用提供一定可靠的藥物理論依據。但本研究仍有一定的局限性，如中藥方劑的服用需要結合患者的臨床癥狀進行具體辨證論治，由于數據庫查詢相關數據不全，可能會忽略中藥成分含量、藥物與成分間相互作用、體內其他藥代動力學的影響等因素，其具體藥理機制還需要得到更深入的科學研究和實驗證明。