基于GC-IMS 技術(shù)分析不同酵母菌發(fā)酵藍莓酒風味物質(zhì)

嚴紅光，張建煬，霍羽佳，袁 瑋

（1.凱里學院大健康學院，貴州凱里 556001；2.黔東南苗族侗族自治州食品藥品檢驗檢測中心，貴州凱里 556001；3.山東海能儀器股份有限公司，山東濟南 250001）

藍莓為杜鵑花科（Ericaeae）越橘屬（VaccimiumL.）灌木，原產(chǎn)加拿大和北美交界處，引種至我國已有30 多年歷史，目前已在10 多個省廣泛栽培，其中貴州省麻江縣栽培面積接近十萬畝[1]。藍莓果實富含多酚、花色苷、適宜的糖酸比，已經(jīng)大量用于釀造果酒[1-4]。果酒風味物質(zhì)是構(gòu)成果酒典型性和決定品質(zhì)等級的關(guān)鍵因素之一，主要受到原料、發(fā)酵和陳釀三大因素影響[3]。其中酵母菌作為果酒釀造的靈魂，在發(fā)酵過程中大量形成酯類、高級醇類、醛類、酮類等風味物質(zhì)，能夠顯著影響果酒的風味特征[2-3]。

目前用于揮發(fā)性風味物質(zhì)研究的技術(shù)手段主要包括氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）、電子鼻法、氣相色譜嗅覺測量法（GC-O）等[5]。其中氣質(zhì)聯(lián)用法存在耗時長、處理程序復雜、碎片峰解譜難等缺點，電子鼻法雖然操作簡單，重現(xiàn)性好，但是存在精度較低、傳感器易漂移等缺點，GC-O 法則存在重復性、穩(wěn)定性不高等缺點[6]。氣相色譜離子遷徙譜（GC-IMS）方法具有樣品處理簡單、最大程度保留自身風味物質(zhì)、高分辨率等特點[5]。目前GC-IMS 技術(shù)已經(jīng)在食用油摻假檢測[7-8]、煙熏食品[5]和干燥食品[9]加工、保藏期間的風味變化[10-11]以及白葡萄酒的分類[12]和異味[13]檢測、酵母菌發(fā)酵過程中葡萄酒風味特征動態(tài)變化[14]等方面取得較好應用。

由于商業(yè)活性干酵母具有啟酵迅速、發(fā)酵性能穩(wěn)定，保藏和使用方便等優(yōu)勢，在釀酒工業(yè)上獲得大量推廣。有研究利用GC-MS 和感官評價發(fā)現(xiàn)不同商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵藍莓果酒后香氣特征差異顯著[15-19]。Liu 等[20]利用GC-MS 研究了9 種商業(yè)活性干酵母發(fā)酵龍眼果酒，發(fā)現(xiàn)影響香氣特征最主要的因素是酵母菌種類，其次是龍眼果汁含量和發(fā)酵后酒精含量。Yang 等[21]利用GC-MS 分析3 種商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵碭山梨果酒后發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)性物質(zhì)總量、醇、酯類化合物含量和組成隨菌種改變而發(fā)生變化。Florin 等[22]根據(jù)篩選的18 種揮發(fā)物質(zhì)檢測結(jié)果建立指紋圖譜，有效識別出8 種商業(yè)活性干酵母發(fā)酵葡萄酒香氣特征差異。Liu 等[23]對2 個南高種群藍莓品種果實進行酒精發(fā)酵，GC-MS 分析發(fā)現(xiàn)萜類香氣物質(zhì)部分水解后導致其相對含量減少。商業(yè)活性釀酒干酵母是經(jīng)過長期選育獲得，具有優(yōu)良發(fā)酵特性，同時不同菌種分別具有增香、酒精發(fā)酵停滯后重新啟動發(fā)酵、吸附色素等功能。對其進行果酒發(fā)酵后分析其揮發(fā)性物質(zhì)代謝特征，有利于指導篩選適宜釀酒酵母菌株資源。本文選擇四種不同來源商業(yè)活性干酵母，利用近年來出現(xiàn)的GC-IMS 技術(shù)分析其發(fā)酵中國南方地區(qū)普遍栽培的兔眼種群(Vaccinum ashei)杰兔藍莓(Premier)釀造果酒揮發(fā)性物質(zhì)組分，以期為后續(xù)釀酒酵母篩選工作，拓展GC-IMS 新技術(shù)應用范圍，加深對藍莓果酒風味物質(zhì)特征認識，及改進藍莓果酒香氣特征品質(zhì)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杰兔藍莓成熟果實 貴州麻江中國南方藍莓繁育基地；Angel ADT 活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司；Lalvin K1、Uvaferm 43、Lalvin DV10活性干酵母 法國拉曼公司；氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉 分析純，西隴化工有限公司；亞硫酸鈉法國拉曼公司；蔗糖 市購。

FlavourSpec?風味分析儀配備自動頂空進樣器德國G.A.S.公司；CP214 萬分之一電子天平 美國OHAUS 公司；bn/qnyz-20 氣囊壓榨機 河北博釀釀酒設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣酒制備 參考課題組前期方法[1]進行，選擇杰兔藍莓成熟果實，經(jīng)0.8 MPa 氣囊壓榨取汁，加二氧化硫50 mg/L，4 ℃靜置8 h 后用蔗糖調(diào)整總糖含量為220 g/L，添加磷酸二氫銨150 mg/L、添加碳酸氫鉀至pH 為3.3，置入2.5 L 帶水封果酒發(fā)酵瓶，裝載量80%，分別接種0.1%法國拉曼K1、UV43、DV10活性干酵母和安琪ADT 活性干酵母，于25 ℃進行酒精發(fā)酵，四種活性干酵母釀造的藍莓果酒依次編號為K、UV、DV 和A。殘?zhí)峭Ｖ瓜陆岛罅⒓捶蛛x酒腳，補加二氧化硫30 mg/L，99.5%裝罐量陳釀30 d后取樣待測。三次重復試驗。

1.2.2 基本理化指標測定 酒精度、總糖、總酸、揮發(fā)酸、干浸出物測定按照GB/T 15038-2006[24]進行。

1.2.3 GC-IMS 測定揮發(fā)性成分 樣品預處理：取1 mL 酒樣置于20 mL 頂空瓶中，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min，45 ℃孵育15 min 后進樣。

GC-IMS 分析條件：色譜柱WAX 30 m×0.53 mm ID，柱溫60 ℃，載氣/漂移氣均為≥99.999%氮氣，IMS溫度45 ℃，分析時間30 min。自動進樣體積100 μL，進樣針溫度50 ℃。

氣相色譜條件：0～2 min：漂移氣150 mL/min，載氣2 mL/min；2～20 min：漂移氣150 mL/min，載氣2 mL/min 提升至100 mL/min；20～30 min：漂移氣150 mL/min，載氣100 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用GC-IMS 儀器配置的LAV (Laboratory Analytical Viewer)軟件查看分析譜圖，Reporter 插件進行二維和三維譜圖差異比較，GC × IMS Library Search 軟件利用內(nèi)置NIST 數(shù)據(jù)庫和IMS 數(shù)據(jù)庫對揮發(fā)性物質(zhì)進行定性分析，Gallery Plot 插件進行不同樣品間揮發(fā)性有機物含量差異比較，Dynamic PCA 插件進行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種商業(yè)活性干酵母發(fā)酵藍莓果酒基本理化指標

表1 為四種商業(yè)活性干酵母發(fā)酵杰兔藍莓果酒三次重復實驗樣品基本理化指標測定結(jié)果。從表1可見：藍莓果酒酒精含量范圍為10.4%～11.0%，總糖含量為1.8～11.5 g/L，干浸出物含量為16.6～17.3 g/L，總酸含量范圍為7.5～8.2 g/L，揮發(fā)酸含量范圍為0.2～1.1 g/L。K、A、DV 三個樣酒彼此間酒精度、干浸出物、總酸差異不顯著，殘留總糖差異顯著（P＜0.05）。殘?zhí)呛徒湍妇凭D(zhuǎn)化率有關(guān)，殘?zhí)窃礁撸凭D(zhuǎn)化率越低[18]。UV 活性干酵母發(fā)酵獲得的藍莓果酒中酒精度、干浸出物、總糖、揮發(fā)酸含量與DV 樣酒差異顯著（P＜0.05）；總酸含量與DV 差異不顯著，但是與K、A樣酒差異顯著（P＜0.05）。相對于其它三種酵母，UV 43 活性干酵母釀造藍莓果酒酒精度含量顯著較低（P＜0.05），而總糖、總酸和揮發(fā)酸含量相對較高。這可能是由于UV 43 酵母屬于發(fā)酵重啟酵母，適宜在酒體發(fā)酵后期含有較低含量氮源、較高含量乙醇和C8、C10 飽和脂肪酸帶來的協(xié)同抑制作用下，補充加入酒體，發(fā)酵殘?zhí)牵a(chǎn)酒精效率較低。試驗結(jié)果預示，UV 43 重啟酵母不太適合完成整個酒精發(fā)酵過程，更適宜后期補加發(fā)酵。

表1 四種酵母菌發(fā)酵藍莓果酒基本理化指標Table 1 Physical and chemical indexes of blueberry wines fermented with four yeasts

2.2 藍莓果酒揮發(fā)性成分GC-IMS 定性分析

利用GC-IMS 分析四種商業(yè)活性干酵母發(fā)酵藍莓果酒揮發(fā)性成分，根據(jù)物質(zhì)峰保留時間，遷移時間和峰強度生成三維數(shù)據(jù)譜圖。由于三維圖組間差異觀察較困難，因此將其投影獲得二維俯視圖。圖1顯示了四種酵母菌發(fā)酵藍莓果酒后全部揮發(fā)性物質(zhì)二維圖譜。

圖1 四種酵母菌發(fā)酵藍莓果酒GC-IMS 二維譜圖及定性結(jié)果Fig.1 GC-IMS two-dimensional spectrum and qualitative results of blueberry wines fermented with four yeasts

從圖1 可見，圖中標注圓圈位置處UV 樣品揮發(fā)性物質(zhì)含量最高，DV、A 和K 樣品含量依次逐步減少。圖1 中標注三角形和矩形位置處K 樣品揮發(fā)性物質(zhì)含量高于其它三個樣品，這說明四種活性干酵母K、A、DV、UV 發(fā)酵藍莓酒后具有不同的揮發(fā)性物質(zhì)組分特征。

為進一步分析主要揮發(fā)性物質(zhì)變化情況，根據(jù)每種揮發(fā)性物質(zhì)保留時間和遷徙時間，使用正酮C4～C9外標計算每種化合物保留指數(shù)，與GCIMS 內(nèi)置NIST 數(shù)據(jù)庫和IMS 數(shù)據(jù)庫進行定性比對分析。從圖1 中4 種藍莓果酒樣品均識別出26 種揮發(fā)性物質(zhì)組分，結(jié)果見表2。圖1 和表2 中物質(zhì)編號均一致。由于相關(guān)數(shù)據(jù)庫正在完善中，因此圖1中部分揮發(fā)性物質(zhì)未能識別。

從表2 可知，藍莓果酒中識別出的26 種揮發(fā)性物質(zhì)主要為酯類、醇類物質(zhì)，其中酯類物質(zhì)13 種，醇類物質(zhì)6 種，酸類物質(zhì)3 種，醛類物質(zhì)2 種，酮類物質(zhì)2 種。有研究[15-18]利用GC-MS 分析了藍莓果酒中揮發(fā)性物質(zhì)組分，發(fā)現(xiàn)主要是醇類和酯類化合物，與本研究結(jié)論一致。如蓋禹含等[2]利用HP-SPMEGC-MS 技術(shù)分析三種釀酒酵母菌發(fā)酵北陸品種藍莓，共識別出76 種揮發(fā)性物質(zhì)，除了醇類、酯類化合物，還識別出占總峰面積比2.31%的7 種萜烯類化合物。這可能是由于GC-IMS 分析過程中，樣品處理沒有SPME 吸附過程以及儀器配套使用的數(shù)據(jù)庫尚有待進一步完善，圖1 中部分未知揮發(fā)性物質(zhì)未能被定性識別有關(guān)。曹雪丹[4]和Liu 等[23]分別利用GC-MS 分析南高種群藍莓果實發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)差異，主要是醇類和酯類化合物，而萜類化合物在藍莓酒發(fā)酵后受水解作用顯著減少。這可以部分解釋樣酒GC-IMS 檢測結(jié)果未能識別出作為品種香重要組成的萜類化合物。

表2 二維譜圖中部分揮發(fā)性物質(zhì)定性結(jié)果Table 2 Qualitative results of some volatile substances in the two-dimensional spectrum

2.3 藍莓果酒揮發(fā)性成分指紋圖譜分析

利用GC-IMS 配置的Gallery Plot 插件可以進一步比較四種酵母菌發(fā)酵藍莓酒樣品中揮發(fā)性有機物含量差異。根據(jù)識別出的揮發(fā)性有機物含量和組成，插件構(gòu)建出指紋圖譜（圖2）。從圖中可以直觀比較出每種樣品的完整揮發(fā)性有機物信息以及樣品之間揮發(fā)性有機物的差異。

由圖2 可知：A 區(qū)域為酯類物質(zhì)，其種類遠多于醇類、醛類結(jié)構(gòu)化合物。四種樣酒中普遍含量較高的包括甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、異丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸異丁酯。但是乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、己酸乙酯二聚體、辛酸乙酯在K 和DV 樣酒中含量顯著高于A 和UV 樣酒。酒精發(fā)酵過程中醇與游離有機酸反應形成酯類物質(zhì)，具有相對較低的閾值和令人愉悅的果味，花香或草本氣味[25]。酯類物質(zhì)對藍莓果酒香氣特征貢獻最顯著[15]。Yang 等[21]也發(fā)現(xiàn)不同酵母菌種發(fā)酵碭山梨后酯類物質(zhì)組成差異顯著，說明酵母菌種的選擇影響果酒的主要香氣特征。

圖2 四種酵母菌發(fā)酵藍莓果酒揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜Fig.2 Volatile substances fingerprint of blueberry wines fermented with four yeasts

B 區(qū)域為醇類物質(zhì)，四種樣酒均含有乙醇、丙醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、1-丁醇、1-己醇，含量稍有差別。DV 樣酒含有相對較高的1-丁醇，屬于高級醇，有利于藍莓酒醇香的形成。由于K 和DV 樣酒酯/醇比例高于A 和DV 樣酒，因此K 和DV 活性干酵母釀造藍莓果酒偏向酯香型，而A 和DV 活性干酵母釀造藍莓果酒偏向醇香型。郭成宇等[3]利用不同釀酒酵母發(fā)酵獲得的藍莓酒也分別呈現(xiàn)出醇香或酯香特征，與本研究結(jié)論一致。文獻[1-2,15]利用SPME-GC-MS 分析出藍莓果酒樣品中最主要的醇類物質(zhì)成分是3-甲基-1-丁醇，Chen 等[26]利用HS-GC-IMS 分析辣椒干燥過程中揮發(fā)性物質(zhì)組分，識別出3-甲基-1-丁醇。本文4 種酵母菌發(fā)酵樣酒均未能檢測出3-甲基-1-丁醇，這可能是由于藍莓產(chǎn)地不同或栽培管理方式差異導致。

C 區(qū)域為酸類物質(zhì)，四種樣酒均含有乙酸、2-甲基丙酸、2-甲基丁酸，但是乙酸、2-甲基丙酸在UV 樣酒中含量較高，2-甲基丁酸在K 樣酒中含量較高。過量的乙酸會導致出現(xiàn)不愉快的氣味和揮發(fā)酸超標[18]。但是適量的酸有助于減緩酯類物質(zhì)的水解反應[21]。

四種酵母菌發(fā)酵樣酒中檢測到乙偶姻、丙酮、苯甲醛、乙醛等揮發(fā)性物質(zhì)。其中乙偶姻在A 樣品中含量較高，可產(chǎn)生令人愉快的奶油香味。適量的酮類和醛類揮發(fā)性物質(zhì)有助于豐富藍莓果酒的香氣特征。

2.4 藍莓果酒揮發(fā)性成分相似度分析

根據(jù)對特征揮發(fā)性物質(zhì)離子峰的保留指數(shù)、遷移時間數(shù)據(jù)、各樣品中物質(zhì)峰體積數(shù)據(jù)綜合分析得出相似度分析表（表3）。四種酵母菌釀造藍莓酒樣品組內(nèi)相似度較高，為85%～94%。組間相似度相對較低，其中Angel ADT 與Lalvin K1 發(fā)酵藍莓果酒樣品之間相似度僅有60%，說明不同活性干酵母菌種的選擇能夠明顯影響藍莓果酒風味特征。

表3 四種酵母菌發(fā)酵藍莓果酒樣品相似度分析Table 3 Similarity analysis of blueberry wines fermented with four yeasts

2.5 藍莓果酒揮發(fā)性成分主成分分析

為了直觀分析四種活性干酵母發(fā)酵藍莓果酒風味物質(zhì)差異，使用Dynamic PCA 插件程序制作樣酒主成分分析圖，結(jié)果如圖3。PC1 和PC2 的貢獻解釋了總變異的70%，且四種酵母菌發(fā)酵藍莓果酒樣品能很好地分離，證明樣酒的特征風味物質(zhì)具有一定差異。Lalvin K1 活性干酵母發(fā)酵樣酒K 聚集在主成分分析圖右側(cè)，Lalvin DV10 活性干酵母發(fā)酵樣酒DV 聚集在圖上方，Angel ADT 活性干酵母發(fā)酵樣酒A 聚集在圖左下側(cè)，Lalvin Uvaferm 43 活性干酵母發(fā)酵樣酒UV 聚集在圖左上側(cè)。由PCA 結(jié)果可知，四種酵母發(fā)酵的藍莓酒風味各不相同，其中A 與UV 樣酒的相似度稍高。

圖3 四種酵母菌發(fā)酵藍莓果酒主成分分析結(jié)果Fig.3 Principle component analysis of blueberry wines fermented with four yeasts

3 結(jié)論

應用GC-IMS 技術(shù)分析了四種商業(yè)活性干酵母釀造的藍莓果酒中26 種揮發(fā)性物質(zhì)，構(gòu)建的指紋圖譜信息和主成分分析結(jié)果表明，釀酒酵母菌種明顯影響果酒的酯類、醇類、乙偶姻等香氣物質(zhì)組分，其中Angel ADT 酵母發(fā)酵后乙偶姻含量較高。研究結(jié)果為后續(xù)深入認識釀酒酵母調(diào)控藍莓果酒風味特征物質(zhì)提供依據(jù)。由于GC-IMS 的樣品前處理尚未應用SPME 技術(shù)及內(nèi)置NIST 數(shù)據(jù)庫有待完善，其識別出的揮發(fā)性物質(zhì)種類較GC-MS 分析結(jié)果相對較少。藍莓樣酒中未能識別出萜類品種香和3-甲基-1-丁醇發(fā)酵醇香物質(zhì)。后續(xù)將結(jié)合SPME-GC-MS 等技術(shù)，進一步完善藍莓果酒揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜，開發(fā)其應用價值。