高通量測序與傳統純培養方法在溱潼魚丸微生物群落分析中的應用對比研究

張璟晶，彭慶旺，陳玉勇，唐勁松，秦金燕

（江蘇農牧科技職業學院食品科技學院，江蘇 泰州 225300）

溱潼魚丸是江蘇省泰州市姜堰區傳統魚糜制品小吃，從古至今制作工藝講究，保持和突出了傳統產品的優點，但溱潼魚丸因工藝的特殊性在原料及加工過程中會帶入微生物，也可能由于包裝或儲藏等因素而更容易出現變質現象。目前國內對魚丸的研究主要集中在魚丸加工工藝的研究和影響魚丸質量的因素上，而對魚丸中微生物結構的分析及導致腐敗的微生物研究鑒定甚少，對溱潼魚丸中微生物群落分析及腐敗菌的鑒別尚未見報道。

目前常通過分離純化、個體形態鑒定、生理生化鑒定等對微生物種類進行鑒定[1-2]。以16SrDNA特定可變高通量測序是近年研究微生物種類多樣性的新手段，對于研究微生物群落的組成及比例具有明顯的優勢[3]。目前該技術應用在不同種類食品中的微生物分析鑒定[4-6]，但該技術在水產品魚糜制品中的應用研究尚未見報道。本文采用IIIumina HiSeq第二代測序技術對溱潼魚丸在4℃下儲藏期內微生物的多樣性進行測序，并與傳統方法結合，對溱潼魚丸中微生物結構的多樣性進行分析，對主要微生物進行分離鑒定，研究溱潼魚丸中微生物的種類及其在儲藏期間微生物的變化，為下一步魚丸的防腐保鮮、延長產品的保質期奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

試驗用魚丸購自溱潼農貿超市。

營養瓊脂培養基（NA培養基）、營養肉湯（NB肉湯）、革蘭氏染色液、微生物生理生化微量鑒定管等：北京陸橋技術有限責任公司；PCR擴增試劑及引物、DNA提取試劑盒、溶菌酶等：生工生物（上海）股份有限公司。

1.1.2 儀器與設備

EL270型電子天平：梅特勒-托多利儀器（上海）有限公司；LDZX30FA型立式壓力蒸汽滅菌鍋、HPX9162型電熱恒溫培養箱、SW-CJ-ZFD型超凈工作臺：上海博訊實業有限公司；PTC200型PCR擴增儀、YLN2000A型凝膠成像分析儀：生工生物（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 魚丸預處理

將從市場買來的魚丸表面用75%的無水乙醇擦拭后晾干，于無菌環境下定量分裝，至無菌袋中，每袋10 g，分為兩組（A組和B組），于4℃低溫下儲藏。

1.2.2 魚丸預增菌處理

將魚丸分組進行取樣，A組魚丸按儲藏時間在第1天和第3天取樣后，使用蛋白胨肉湯進行30℃過夜增菌培養，記為A1、A3；B組魚丸于第1天和第3天取樣后不增菌，記為B1、B3。

1.2.3 平板分離培養和菌株種類鑒定

1.2.3.1 平板分離培養

將B組魚丸分別在第1、3、5、7、9天進行取樣，每次取一袋，加入90 mL無菌水，均質后制成10-1稀釋液，然后進行10倍系列梯度稀釋[7]。選擇適宜的稀釋液混勻后分別取1 mL加入無菌平皿，后倒入無菌營養瓊脂（NA）20 mL，混勻，冷卻凝固后，將平皿倒置于培養箱中，30℃培養（72±2）h。

1.2.3.2 菌株種類的鑒定

觀察在NA培養基上分離得到的菌落的特征，挑取具有不同典型形態特征的菌落，分別進行分離純化，以獲得純種，后保存在試管斜面中，備用。

參照Bagge-Ravn等[8]的方法以及《常見細菌系統鑒定手冊》[9]對分離得到的純種進行鑒定。

1.2.4 高通量測序分析方法

1.2.4.1 DNA提取和PCR擴增

將分組魚丸按不同時間分別取樣約10 g，放入滅菌袋中，磨碎，在超凈工作臺中加入90 mL生理鹽水于滅菌的錐形瓶中，振蕩30 min。將得到的渾濁液轉移到離心管中，于4℃下以4 000 r/min離心10 min，去上清液于離心管中，繼續于4℃下以1 000 r/min離心20min，將沉淀轉移EP管中，并于-20℃下保存[10-11]。

PCR反應體系為50μL，包括：2μL DNA模板、1μL正向引物、1μL反向引物、25μL 2xTap MasterMix、21μL dd H2O。PCR反應過程：94℃預變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10 min，1個循環。正向引物8F（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’）和1541R（5’-AAG GAGGTGATCCAACCGCA-3’）。

1.2.4.2 測序數據處理

委托生工生物（上海）股份有限公司對以上樣品進行宏基因組微生物分類測序。

對IIIumina HiSeq測定溱潼魚丸中微生物群落的結果進行分析，去除3’端引物接頭序列，根據PE reads之間的overlap關系將成對reads拼接成一條序列，根據各樣本barcode序列從融合后數據中分割出樣本數據，去除各樣本中reads尾部質量值在20以下的堿基，切除reads中含N部分序列，并去除數據中的短序列，長度閾值200 bp，最后再對低復雜的序列進行過濾，去除嵌合體及非特異性擴增序列，得到有效數據。

1.2.4.3 操作分類單元（Operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種注釋

利用Usearch軟件[12]對“1.2.4.2”得到的序列按照序列間的距離進行聚類操作。將所測得序列在97%相似水平下聚類為不同的操作分類單元（OTUs），進行生物信息統計分析。

2 結果與分析

2.1 傳統純培養分離鑒定結果分析

采用營養瓊脂培養基對各樣品中可以培養的微生物進行了分離與純化，通過選取菌落形態各異的菌株共獲得37株菌株，經革蘭氏染色、形態學鑒定、生理生化鑒定等進行初步分類鑒定，結果見表1。由表1可以看出，假單胞菌屬在所鑒定菌株總數中占比較高（45.9%），葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬、微球菌屬和芽孢桿菌屬也占有一定比例。傳統純培養分離鑒定的方法受環境培養條件影響較大，往往不能鑒定出冷藏魚丸中的所有微生物種類，且該方法一般耗時較長，各種魚糜制品附著微生物群落組成差異不盡相同。

2.2 高通量測序結果

2.2.1 OTU物種注釋

本研究通過采用Illumina Hiseq測定B組魚丸樣本得到原始序列條數259 438個，過濾掉低質量序列后，有效序列總數為253 397個。根據Barcode標簽序列識別并區分樣品得到各樣本數據，對各樣本數據的質量進行質控過濾得到有效數據，并在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTUs，得到溱潼魚丸中群落結果組成，并統計得到各個樣品在不同OTUs中豐度信息（序列數）。

采用Krona軟件對B1樣品中所附著的細菌OTUs進行物種注釋，結果如圖1所示。共鑒定出21個門，39個綱，49個目，49個科，52個屬。圖1中由最內圈向外依次分別代表溱潼魚丸中附著細菌在界、門、綱、目、科、屬水平下的物種組成，不同顏色的扇形代表不同菌屬，扇形面積的大小代表不同OTUs注釋結果的相對比例。

從圖1中可以看出：魚丸中微生物種類在門水平上，以變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）為主，分別占46%和31%；在綱水平上群落組成，變形菌綱（Gammaproteobacteria）屬于優勢菌綱，占37%；放線菌綱（Actinobacteria）次之，占31%；在目水平上群落組成，假單胞目（Pseudomonadales）占33%；放線菌目（Actinomycetales）次之，占31%；在科水平上群落組成，優勢菌科為微球菌科（Micrococcineae）占31%，其次為莫拉式菌科（Moraxellaceae）和假單胞菌科（Pseudomonadaceae），分別占18%和15%；在屬水平群落組成，假單胞菌屬（Pseudomonas）是絕對優勢菌屬，占15%；其余主要菌屬為考克氏菌屬（Kocuria）占12%，皮生球菌屬（Dermacoccus）占11%，水棲菌屬（Enhydrobacter）占11%，鏈球菌屬（Streptococcus）占5%，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）占5%，乳球菌屬（Lactcoccus）占4%，葡萄球菌屬（Staphylococcus）占3%。

圖1 物種注釋結果Fig.1 Species annotation results

2.2.2 分類與系統進化關系

通過使用GraPhIAn和iTOL軟件，選擇豐度排名靠前的20個菌屬（以字母A～T進行表示）所對應的OTUs數據，構建分類與系統發育圖（圖2）。圖中顯示最里圈為代表序列所構建的系統發育樹，分別用不同的顏色代表不同的菌屬，其中系統發育樹中圈和星號的大小代表菌屬豐度大小。第2層為外圍熱力圖，每一環代表不同的樣本，OTUs的相對豐度分布由顏色深淺變化表示；第3層是OTUs注釋可信度分布，柱子的高度表示其可信度。

由圖2可以看出，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）相對豐度較高，同時兩種菌屬在系統進化關系上也很接近。大量研究表明，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）是典型的耐寒性細菌，主要是水產魚類表面的優勢腐敗菌，在很多水產加工制品和冷藏肉類調理食品中，嗜冷桿菌屬仍然是其主要的優勢腐敗菌[13-15]。

圖2 魚丸樣品OTUs的系統發育關系圖Fig.2 Phylogenetic relationshipsof OTUs fromfish balls

假單胞菌（Pseudomonas）也具有一定的耐冷特性，冷藏條件下也是肉類腐敗過程中最主要的腐敗菌之一，當假單胞菌的菌數達到一定水平，就會導致肉品產生異味[16-17]。

2.2.3 溱潼魚丸樣本聚類樹圖分析

通過樣本聚類樹圖可以直觀看出溱潼魚丸多個樣品間的相似性和差異性，結果如圖3所示。A組樣品經過室溫增菌后進行菌屬分析檢測，從魚丸中所具有微生物菌屬種類數量來看與B組（未增菌組）相差并不大，但隨著儲藏時間的延長，其中主要菌屬所占比例變化較大，尤其是假單胞菌屬（Pseudomonas）比例大幅度增加，說明在室溫下假單胞菌屬（Pseudomonas）在溱潼魚丸中的生長繁殖速度遠快于其他菌屬。而B組樣品隨著時間的延長，其菌屬的種類逐漸趨于單一，說明在4℃低溫下，嗜冷性或耐冷性的菌屬逐漸適應了環境在溱潼魚丸中逐漸占有優勢，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）和嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）幾乎呈交替上升的趨勢，從而對其他菌屬的生長造成了一定的影響。隨著冷藏時間的延長，B7與B3、B5樣品中的微生物細菌菌群的相似性有所降低，說明了儲藏時間的延長對魚丸種菌落組成的相似發生了變化，這對魚丸中細菌微生物的菌群組成具有一定的影響。

圖3 屬水平上所有樣本聚類樹與柱狀圖組合分析圖Fig.3 The combined analysischart of clustering tree and histogramfor all samples at genuslevel

2.2.4 樣品的多樣性指數分析

溱潼魚丸中微生物群落的豐度和多樣性可以由樣本多樣性指數反映。Coverage代表各樣本文庫覆蓋率，其數值越高，則樣本中序列被測的概率越高。由表2結果可知，所有樣本的覆蓋率均在0.99以上，說明本次測序檢測對樣本中細菌的覆蓋率很高，測序深度合適，可滿足樣品中細菌的多樣性分析需要[18]。

表2 各樣品的多樣性指數Table 2 Diversity index of each sample

Ace和Chao1指數主要反映樣品菌樣豐度，Shannon和Simpson則反映樣品群落多樣性[19]。從A組數據可以看出，隨著儲藏時間的延長，A3樣品的Shannon值升高，Simpson值降低，說明其樣品群落的多樣性在增加，經過室溫增菌培養后，魚丸中的微生物菌群種類在增加；B組樣品中，在低溫儲藏最初階段，Shannon值較高，Simpson值較低，說明其菌群多樣性較高，但隨著儲藏時間的延長，菌樣的多樣性有所降低，其原因可能是低溫作用抑制了部分微生物的生長與繁殖，致使魚丸中微生物結構發生了變化，而其菌樣的豐度增加主要出現在魚丸中的主要腐敗菌。

3 討論與結論

通過以上試驗可以看出，傳統純培養分離鑒定的方法和高通量測序法雖然都能分析出假單胞菌屬（Pseudomonas）在溱潼魚丸微生物菌群中占有較大比例，但所占比例有一定差異。本試驗中，雖然傳統分離法較容易操作，但分離出的微生物種類的數量遠低于高通量測序法，且傳統培養方法因為樣本數量和培養條件的限制，所分離出的菌屬種類不能完全反映出魚丸中微生物菌群的種類及比例，尤其傳統純培養分離鑒定對于溱潼魚丸儲藏初期比例（豐度）較小的菌屬分離鑒定有一定偏差，而高通量測序法對其中主要微生物菌群及動態變化均能有較為詳細的呈現。高通量測序除了鑒定出魚丸中絕對優勢菌是假單胞菌屬，還揭示了溱潼魚丸中菌群的演替規律，假單胞菌屬（Pseudomonas）是溱潼魚丸儲藏初期的絕對優勢菌屬，除此之外，水棲菌屬（Enhydrobacter）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）等也占有一定比例。但隨著儲藏時間的延長，至儲藏第7天時，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）的數量逐漸占有優勢，其與假單胞菌屬（Pseudomonas）均成為冷藏魚丸中的優勢菌。這與儀淑敏等[20]通過PCR-DGGE法研究發現魚糜制品中優勢腐敗菌可能是嗜冷桿菌的研究結果相近。

針對以上結果推測如果在溱潼魚丸儲藏前期通過對假單胞菌屬（Pseudomonas）進行減菌化處理，同時采取有效措施控制嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）的生長繁殖速度，將有助于改善溱潼魚丸的品質，延長其貨架期。