襄陽地區中高溫大曲曲皮和曲心真菌多樣性解析

鄧長陽，黎婷玉，劉文匯，吳興茹，劉忠軍，郭 壯

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市釀酒生物技術與應用企校聯合創新中心，湖北 襄陽 441053；3.湖北古襄陽酒業有限公司，湖北 襄陽 441100）

作為世界六大蒸餾酒之一，白酒不僅具有悠久的歷史文化，同時獨特的生產發酵工藝還賦予了其以酯類為主體的復合香味[1-2]。濃香型白酒作為我國白酒的典型代表之一，具有綿柔甘冽、芳香濃郁、入口甜、落口綿和尾凈余長等特點，在我國白酒行業中占據著重要的地位[3]。大曲是濃香型白酒釀造過程中的最主要的發酵劑和糖化劑，在白酒的發酵過程中扮演著重要的角色[4]。大曲中富含著豐富的微生物群系，且以真菌為主參與了濃香型白酒的發酵生產[5]，如霉菌具有蛋白酶、糖化酶和淀粉酶等豐富的酶系可對發酵基質中的碳水化合物和蛋白質等進行水解，進而促進發酵的進行[6]；而酵母菌則具有酒精發酵和產香能力，對于酒精和香味物質的生產具有重要的作用[7]。

最早有關大曲中真菌類群的研究主要是基于傳統微生物學手段完成的，如羅惠波等[8]對采集于瀘州老窖的大曲真菌進行了分離鑒定，發現曲霉屬（Aspergillus）為其優勢種群。隨著測序技術的迅速發展，以Illumina MiSeq為代表的第二代高通量測序技術在發酵食品微生物類群解析方面有著廣泛的應用[9]，如JI Z等[10]通過對麥曲進行高通量測序，解析了其真菌類群的多樣性，為提升黃酒品質提供了一定的參考依據。

近年來，為了賦予酒體一定的醬香風味，中高溫大曲逐漸被應用于濃香型白酒的釀造。本研究使用Illumina MiSeq高通量測序技術對襄陽地區中高溫大曲的真菌多樣性進行解析，同時結合多元統計學手段對其曲皮和曲心中真菌類群的差異進行甄別，以期為襄陽乃至華中地區白酒制曲工藝的改良提供一定的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲：所有中高溫大曲均采集自湖北省襄陽市某酒業有限公司制曲車間。

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；FastPfu Fly DNA Polymerase、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）Mix和FastPfuBuffer：北京全式金生物技術有限公司；引物ITS3F/ITS4R（ITS3F：5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'；ITS4R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）：武漢天一輝遠生物科技有限公司合成；MiSeq高通量測序配套試劑：美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Thermo公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統：美國ProteinSimple公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；Veriti FAST梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；sigma 3K15臺式高速冷凍離心機：德國SIGMA公司；R930型機架式服務器：美國DELL公司；YL90L3-4磨粉機：山西泰禾工貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

所采集的中高溫大曲以小麥為主要原料制作而成，潤糧時間為30 min，成型后長寬高為37 cm×18 cm×7 cm，入庫發酵時庫房溫度保持在58～60 ℃，曲塊溫度達到42 ℃進行第一次翻曲，每隔2～3天翻曲一次，發酵30 d后進行貯存成熟。樣品采集時，使用酒精棉擦拭后的鋼鋸在1號中高溫大曲6個側面距表皮約1 cm的位置分別進行切割，靠近表面的部分定義為曲皮，編號為P1，其余部分定義為曲心，編號為X1，將切割下的曲皮和曲心分別使用粉碎機粉碎后按四分法取20 g左右裝入滅菌的離心管備用。共取10個中高溫大曲樣品，各樣品取樣方法相同，編號依次為P1～P10和X1～X10，其中相同數字編號的樣本來自于同一塊大曲。

1.3.2 宏基因組DNA提取和Illumina MiSeq測序

參照王玉榮等[11]的方法采用基因組提取試劑盒對大曲中微生物的宏基因組DNA進行提取，并以其為模板，使用通用引物ITS3F、ITS4R對ITS2區域進行PCR擴增。將檢驗合格后的PCR擴增產物進行測序。

1.3.3 序列質控和生物信息學分析

參照郭壯等[12]的方法對下機序列進行質控，使用QIIME（v1.95）平臺[13]，依次使用PyNAST軟件對序列進行比對[14]、使用UCLUST方法劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[15]、基于UNITE數據庫對每個OTU的代表性序列進行注釋[16]、使用FastTree軟件構建系統發育樹[17]和計算α和β多樣性，進而對曲皮和曲心中真菌類群的豐度和多樣性進行評估。

1.3.4 多元統計學分析

采用Venn圖和瀑布圖對曲皮和曲心中共有的OTU進行識別；使用Wilcoxon檢驗和主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）分別對曲皮和曲心中真菌類群的α和β多樣性進行計算；使用線性判別分析效應大小（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析對曲皮和曲心中真菌類群的差異性進行甄別。本研究中所有的分析和繪圖均使用R（v3.3.2）軟件進行。

2 結果與分析

2.1 基于門和屬水平的曲皮和曲心真菌構成分析

本研究采用高通量測序技術對曲皮和曲心中真菌類群構成進行了揭示，并對其在門水平上的注釋結果進行了分析，結果見圖1。

圖1 中高溫大曲曲皮和曲心中優勢菌門相對含量的分析結果Fig.1 Analysis results of the relative content of dominant fungal phyla in the surface and the center of medium-high temperature Daqu

由圖1可知，所有中高溫大曲樣品中共注釋出7個真菌門，其中優勢菌門（平均相對含量＞1.00%）有3個，分別為子囊菌門（Ascomycota）（73.73%）、毛霉菌門（Mucoromycota）（21.39%）和擔子菌門（Basidiomycota）（2.91%），三者的累計平均相對含量高達98.03%。由圖1亦可知，3個優勢菌門在曲皮和曲心中存在較大的差異，其中曲心主要以Ascomycota為主，其平均相對含量高達93.45%，而曲皮主要以Ascomy cota和Mucoromycota為主，其平均相對含量分別54.01%和38.98%，其累計占比達92.99%。值得注意的是，相較于曲皮，曲心中Mucoromycota的相對含量極低。大曲樣品中優勢真菌屬的相對含量見圖2。

圖2 中高溫大曲曲皮和曲心中優勢真菌屬相對含量的分析結果Fig.2 Analysis results of the relative content of dominant fungal genera in the surface and the center of medium-high temperature Daqu

由圖2可知，從曲皮中共鑒定出6個優勢真菌屬（平均相對含量＞1.00%），分別為隸屬于Ascomycota的嗜熱真菌屬（Thermomyces）、曲霉屬（Aspergillus）、雙足囊菌屬（Dipodascus）和畢赤酵母屬（Pichia），平均相對含量分別為25.39%、8.23%、8.09%和5.35%；隸屬于Mucoromycota的根霉屬（Rhizopus），平均相對含量為38.83%；以及隸屬于Basidiomycota的絲孢酵母屬（Trichosporon），平均相對含量為2.28%。從曲心中共鑒定出9個優勢真菌屬，分別為隸屬于Ascomycota的Thermomyces、熱子囊菌屬（Thermoascus）、Aspergillus、Rasamsonia和Dipodascus，其平均相對含量分別為56.67%、16.86%、9.22%、5.55%和1.43%；隸屬于Mucoromycota的根毛霉屬（Rhizomucor）和Rhizopus，其平均相對含量分別為2.01%和1.49%；以及隸屬于擔子菌門的Trichosporon，其平均相對含量為2.18%。經Wilcoxon檢驗發現，Rhizopus、Dipodascus和Pichia在曲皮中的含量顯著偏高（P＜0.05），平均含量分別為38.83%、8.09%和5.35%，而Thermomyces、Thermoascus、Rasamsonia和Rhizomucor在曲心中的含量顯著偏高（P＜0.05），平均含量分別為56.67%、16.86%、5.55%和2.01%。由此可見，中高溫大曲曲皮和曲心中真菌類群的構成存在一定的差異。

2.2 曲皮和曲心中真菌類群群落結構的比較

本研究進一步對曲皮和曲心中真菌類群的4種α多樣性指數進行了比較分析，其結果見圖3。

圖3 中高溫大曲曲皮和曲心α多樣性指數的比較分析Fig.3 Comparative analysis of α diversity indexes in the surface and the center of medium-high temperature Daqu

香農指數和辛普森指數常用來評估樣本中微生物的多樣性，而超1指數和發現物種數則常用來評估樣本中微生物的豐度[18]。本研究使用Wilcoxon檢驗對兩類大曲中的4種α多樣性指數進行顯著性分析發現，其差異均不顯著（P＞0.05）。由此說明，曲皮和曲心中真菌類群的多樣性和豐度并不存在顯著性差異。本研究進一步基于非加權和加權的UniFrac距離對真菌類群的菌群結構進行了主坐標分析，其結果見圖4。

由圖4可知，基于非加權和加權UniFrac距離的主坐標分析均表明，中高溫大曲中不同部位的樣品在空間排布上呈現出明顯聚類趨勢。

圖4 基于非加權（a）和加權（b）UniFrac距離的主坐標分析Fig.4 Principal coordinate analysis based on unweighted (a) and weighted (b) UniFrac distance

由圖4a可知，曲皮樣本主要位于X軸負方向，曲心樣本則幾乎全部位于X軸正方向，而圖4b亦可以觀察到類似的現象。值得注意的是，相較于非加權UniFrac距離的主坐標分析，加權UniFrac距離的主坐標分析顯示曲皮中的真菌群落結構組間差異更大。由此說明，曲皮中低豐度的真菌類群之間的構成差異較小，而優勢菌屬之間的相對含量存在較大的差異；但曲心中的低豐度物種差異較大，而優勢菌屬的相對含量之間并無明顯的差異。因此，本研究對曲皮和曲心中的共有OTU進行了統計分析，結果見圖5。

圖5 中高溫大曲曲皮和曲心中共有OTU的分析結果Fig.5 Analysis results of common OTU in the surface and the center of medium-high temperature Daqu

由圖5a可知，所有大曲樣品中共篩選出330個代表性OTU（在每組50%的樣品中出現），曲皮中有73個代表性OTU，而在曲心中有290個代表性OTU，且兩組的共有OTU有33個。由圖5b可知，共有5個OTU在所有樣品中出現，可被注釋為Thermomyces和Aspergillus兩個屬，兩個屬分別占總序列數的33.34%和3.27%。而對比圖2亦可知，Thermomyces和Aspergillus主要分布在曲心，而在曲皮中的相對含量較低。由此說明，曲皮中存在大量的非代表性OTU（在每組樣品中出現的頻率不足50%），且其平均相對含量較低；而曲心則存在著較多的代表性OTU，大部分OTU注釋到的菌屬隸屬于優勢菌屬，這也導致大曲中部的低豐度物種的種類較少。此結果與圖4所得出的結論相一致，進一步說明了結果的正確性。同時，本研究通過LEfSe分析對大曲不同部位中差異的微生物進行了解析，結果見圖6。

由圖6可知，本研究通過LEfSe分析共甄別出22個具有差異的微生物類群，其中在屬水平上共甄別到10個差異菌屬，但僅有兩個隸屬于優勢菌屬，分別為Rhizomucor和Thermoascus，且兩者都主要分布在曲皮。由此說明，造成中高溫大曲曲皮和曲心中真菌菌群結構差異的主要是由Rhizomucor和Thermoascus及若干低豐度菌屬造成的。

圖6 線性判別分析效應大小分析結果Fig.6 Analysis results of linear discriminant analysis effect size

3 討論

本研究采用MiSeq高通量測序技術對中高溫大曲曲皮和曲心中的真菌多樣性進行了解析，發現Ascomycota和Mucoromycota為其優勢真菌門，這與前人關于大曲中真菌多樣性的研究結果相一致[19-20]。本研究亦發現Thermomyces、Rhizomucor、Thermoascus、Aspergillus、Dipodascus和Pichia等為大曲中的優勢真菌屬，其累計平均相對含量高達93.12%。前期針對大曲微生物多樣性研究的報道與本研究的結論存在一定的差異，孫利林等[21]研究發現，安徽省北部某酒廠高溫大曲中主要優勢菌屬為Aspergillus和Thermoascus，而CHEN B等[22]通過研究發現，高溫大曲中主要優勢菌種為多變擬青霉（Paecilomyces variotii）和米曲霉（Aspergillus oryzae），導致這種差異的原因可能在于制曲工藝、原料和制作地環境等因素的不同[23-24]。

雖然同一份中高溫大曲的制作工藝、發酵條件和原料等完全相同，但曲皮和曲心的微生物構成依舊存在著較大的差異。本研究結果表明，曲皮主要以Rhizopus和Rhizomucor為主，且不同大曲樣本中存在較多的低豐度物種；而曲心則主要以Thermomyces、Thermoascus、Aspergillus和Pichia等大曲中常見的真菌屬為主，且曲心的低豐度物種數相對較少。調查發現，在貯存成熟過程中同一份大曲曲皮和曲心的溫度并不相同，由于曲皮直接與空氣相接觸，可以直接和空氣進行熱傳遞因而其溫度較之曲心偏低。此外，曲皮的水分含量要低于曲心，加之曲皮與空氣接觸的更為密切，這些均可能是導致大曲不同部位真菌類群存在較大差異的原因。

不可否認的是，本研究使用MiSeq高通量測序技術對中高溫大曲中真菌ITS2區域進行了測序，其僅能在“屬水平”上展開分析討論，且無法對真菌類群發揮的具體功能展開解析[25]，這也使得本研究存在一定的局限性。因此，在后續研究中采用宏基因組學技術在“種”或“株”水平上對襄陽地區中高溫大曲中真菌類群進行解析亦是十分必要的。

4 結論

襄陽地區中高溫大曲曲皮和曲心真菌的豐度和多樣性無明顯差異，但兩者菌群的構成存在顯著的不同。在門水平上，曲心主要以子囊菌門（Ascomycota）為主，而曲皮以子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）為主。在屬水平上，根霉屬（Rhizopus）、雙足囊菌屬（Dipodascus）和畢赤酵母屬（Pichia）在曲皮中的含量顯著偏高，而嗜熱真菌屬（Thermomyces）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、踝節菌屬（Rasamsonia）和根毛霉屬（Rhizomucor）在曲心中的含量顯著偏高。進一步分析發現，Rhizomucor和Thermoascus及若干低豐度物種是造成襄陽地區中高溫大曲曲皮和曲心真菌菌群結構存在差異的關鍵類群。