不同來源濃香型酒醅的揮發性成分差異分析

李慧星，韓朝淇，姚涵譯，許 彬1， *，羅建成

（1.南陽理工學院 河南省工業微生物資源與發酵重點實驗室，河南 南陽 473004；2.南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽 473004；3.南陽理工學院 張仲景國醫國藥學院，河南 南陽 473004）

濃香型是白酒基本香型之一。固態濃香型白酒用單糧或多糧作為發酵原料，以大曲作為糖化發酵劑，原料經長期發酵后形成酒醅。酒醅中的揮發性成分在蒸餾過程中被提取、濃縮，進入原酒，因此原酒中的香氣物質的種類和含量主要取決于酒醅中揮發性成分的種類和含量[1-3]。

酒醅中揮發性成分主要包括酯類、醇類、酮類、醛類、酸類、醚類、酚類、苯環類、烯烴類化合物[4-5]。出窖酒醅的揮發性成分會受到多種因素的影響。酒醅和窖泥中的微生物會影響出窖酒醅揮發性成分，如譚壹[6]研究發現Geortrichum silvicola和庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）與持續發酵段乙酸乙酯、己酸乙酯及丁酸乙酯的增加有關；應靜[7]研究發現甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）可能參與丁酸乙酯生成；趙東等[8]研究發現，窖泥中的微生物與香氣物質不斷地與糟醅發生著相互交換。釀造用糧食會影響出窖酒醅的揮發性成分，如劉睿[9]研究發現，原料中的原花青素會對小曲白酒中異丁醇、異戊醇、乙酸、乙醛、糠醛、乙酸乙酯和乳酸乙酯產生影響；閆涵等[10]發現多糧酒醅比單糧酒醅發酵生成更多的乙酸己酯、肉豆蔻酸乙酯、苯甲醇、6-甲基-2-乙基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪。釀造工藝條件會影響出窖酒醅的揮發性成分，如李杰等[11]的研究表明低溫入窖有利于酵母菌的生長和發酵產酒，有利于酯類物質的生成。出窖酒醅的揮發性成分還受到窖池空間分布的影響，如雷學俊等[4]研究發現酯類和酸類在窖池中的含量分布規律為下層＞中層≥上層，同層糟醅距離窖壁越近含量越高且呈擴散遞減趨勢。

入窖酒醅成分也可能對出窖酒醅的揮發性成分產生影響。濃香型白酒多采用續糟混蒸工藝[4，12-13]，入窖酒醅中除了含有糧食、大曲引入的揮發性成分外[10，14-15]，還含有酒醅蒸餾后的殘留揮發性成分[13，16]，這些成分都將參與下一輪發酵。有報道表明，入窖酒醅酸度對出窖酒醅香氣有顯著影響[17]，但入窖酒醅的揮發性成分對出窖酒醅的影響未見報道。本研究采用頂空-氣相色譜質譜聯用（headspace gas chromatography-mass spectrometry，HS-GC-MS）對不同來源的出窖和入窖酒醅揮發性成分進行分析，比較不同來源的出窖酒醅之間、不同來源的入窖酒醅之間在揮發性成分上的差異，分析入窖酒醅揮發性成分對出窖酒醅揮發性成分可能產生的影響，為控制出窖酒醅質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

同種香型白酒酒醅樣品：兩個白酒生產企業提供，兩個企業均采用高粱、玉米、小麥和糯米為釀造原料，以大曲為釀造用曲，采用續糟發酵工藝。出窖酒醅取樣時，每個來源選取2個發酵期為60 d的窖池，每個窖池分別取窖池上、中、下層中心處的酒醅，共6個樣品。入窖酒醅取樣時，每個來源選取兩個拌料后料堆，每個料堆分別取堆頂、中心、堆底處的酒醅，共6個樣品。所有樣品用封口袋密封保存后于-20 ℃冷凍保藏。

1.2 儀器與設備

Scion SQ-451氣相-質譜聯用儀、SHS-40 SL頂空進樣系統、BR-swax毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）：美國布魯克道爾頓公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

所有樣品解凍后，將同一來源的6個出窖/入窖酒醅取等量（10.0 g）混合，然后精確稱取混勻后的酒醅5.000 0 g放入20 mL頂空瓶中，加入6 mL蒸餾水、2.2 g NaCl，混勻，壓緊瓶蓋。來自A企業的出窖/入窖酒醅分別編號為S_1和S_2，來自B企業的出窖/入窖酒醅分別編號為S_3和S_4。

1.3.2 頂空實驗條件

樣品瓶加熱溫度：50 ℃；閥和定量環加熱溫度：120 ℃；傳輸線溫度：120 ℃；樣品瓶加熱時間：45 min；加熱方式：振蕩加熱；進樣體積：0.25 mL，進樣時間：1 min。

1.3.3 氣相色譜條件

色譜柱：BR-swax毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度35 ℃保持4 min，以3 ℃/min升至150 ℃保持4 min，以5 ℃/min升至220 ℃保持20 min；載氣為氦氣（He），流速2.0 mL/min，分流比5∶1。

1.3.4 質譜條件

電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質量掃描范圍40～350 m/z；數據采集掃描模式：全掃描模式；溶劑延遲時間0.5 min。

1.3.5 數據分析

計算總離子流色譜圖中各峰面積的百分比，作為揮發性成分的相對百分含量[18-19]。利用軟件R3.6.1進行統計分析和數據可視化。以樣本各揮發性成分的相對百分含量為指標計算樣本揮發性成分多樣性距離矩陣、以樣本中各類化合物相對百分含量為指標計算樣本揮發性成分類別距離矩陣和香氣成分類別距離矩陣，利用vegan包進行主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）[22-23]，展示樣本間揮發性成分多樣性的差異[20-21]、樣本間揮發性成分類別差異以及樣本間香氣成分類別差異，利用ggplot2包進行可視化。比較相對百分含量＞1%的揮發性成分在各種酒醅中的分布差異，利用Circlize包進行可視化；利用STAT包中t檢驗函數進行配對樣本t檢驗[24]。

2 結果與分析

2.1 酒醅揮發性成分分析

出窖酒醅和入窖酒醅的揮發性成分總離子流色譜圖如圖1所示。計算各酒醅樣品中的揮發性成分的峰面積相對百分比，為消除含量過低的成分對差異分析的干擾，將相對百分含量≥0.01%的成分作為酒醅中主要揮發性成分，結果見表1。

圖1 出窖酒醅和入窖酒醅揮發成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds in unloading pits and loading pits analyzed by GC-MS

由表1可知，不同來源的出窖和入窖酒醅共檢出42種主要揮發性成分，其中醇類6種、酸類4種、醛酮類8 種、酯類23種、醚類1種；出窖酒醅中檢出41種，入窖酒醅中檢出27種。酯類中乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯的相對百分含量均在2%以上，它們正是濃香型白酒的特征香氣成分[3，24-25]。由于己酸乙酯和乳酸乙酯相對于乙酸乙酯和乙醇揮發性低，在蒸餾過程中在酒醅中殘留比例高于乙醇，因此在兩個來源的入窖酒醅中相對百分含量都增加，這與郎召偉等[5]的報道一致。本實驗樣品中檢出的醛酮類揮發性成分均為五碳以下的醛酮。兩個來源的入窖酒醅中乙酸、丁酸、己酸這三種酸的相對含量都增加，這是由于酸類物質的沸點高，在蒸餾后酒醅中積累進入下一輪發酵。

表1 不同來源酒醅主要揮發性成分分析結果Table 1 Analysis results main volatile compounds in fermented grains from different sources

續表

2.2 不同來源樣品間的差異分析

2.2.1 樣品揮發性成分多樣性差異

由圖2可知，不同來源的出窖酒醅距離接近，說明雖然來源不同，但同種香型的出窖酒醅在揮發性成分多樣性上的差異遠遠小于出窖和入窖間的差異。不同來源的入窖酒醅距離較遠，說明不同來源入窖酒醅在揮發性成分多樣性上存在較大差異，但這種差異要小于出窖酒醅和入窖酒醅在揮發性成分多樣性上的差異。入窖酒醅間的差異有可能是由于蒸酒工藝不同、原料配比差異、大曲來源不同等原因造成的。出窖酒醅間的相似性說明出窖酒醅中揮發性成分的多樣性不會受到入窖酒醅揮發性成分多樣性的干擾。

圖2 不同酒醅揮發性成分多樣性主坐標分析結果Fig.2 Principal coordinates analysis results of volatile compounds diversity of different fermented grains

2.2.2 樣品揮發性成分類別差異

將酒醅中的揮發性成分劃分為醇類、酸類、醛酮類、酯類和其他類，并計算各類的相對百分含量，對樣品揮發性成分的醇類、酸類、醛酮類、酯類和其他類進行主坐標分析（如圖3（a）），以展示樣品在揮發性成分類別上的差異。除乙醇外酒醅中的揮發性成分可以歸結為酒醅香氣成分[8]。將酒醅香氣成分按官能團分劃分為醇類、酸類、醛酮類、酯類和其他類，并計算各類的相對百分含量。對樣品香氣成分的醇類、酸類、醛酮類、酯類和其他類進行主坐標分析（如圖3（b）），以展示樣品在香氣成分類別上的差異。

由圖3（a）可知，不同來源的出窖酒醅間、不同來源的入窖酒醅間的距離與出窖入窖酒醅間距離接近，說明無論出窖入窖、無論哪種來源，樣品在揮發性成分分類上不存在明顯差異。這主要是由于無論出窖入窖、哪個來源的酒醅，乙醇都是揮發性成分中占比最多的成分，且占比接近，與其他成分的占比存在數量級的差異，因此乙醇掩蓋了其他成分給酒醅帶來的差異。由圖3（b）可知，在僅考慮香氣物質時，各樣品間的距離有明顯區別。不同來源的出窖酒醅幾乎重合，不同來源的入窖酒醅距離較遠，但小于出窖入窖酒醅的距離。說明不同來源的入窖酒醅在各類香氣成分的相對占比上也存在差異，但出窖酒醅的各類香氣成分占比不受該差異的影響。

圖3 不同酒醅揮發性成分類別主坐標分析結果Fig.3 Principal coordinates analysis results of volatile compounds classification of different fermented grains

2.2.3 差異性成分分布

由圖4可知，兩種來源的出窖酒醅（S_1和S_3）在相對百分含量＞1%的揮發性成分的分布上比較接近，酒醅S_3揮發性成分中由于乙醇占比較高，其他香氣成分（除乙酸外）的相對百分含量略低于酒醅S_1，酒醅S_1和S_3的揮發性成分中乙酸的相對百分含量接近。經成對樣本t檢驗可知，酒醅S_1和S_3的主要揮發性成分在分布上差異不顯著（P=0.475＞0.05），可見同一香型的白酒出窖酒醅即使來自不同生產企業，在相對百分含量＞1%的揮發性成分分布上也具有相似性。兩種來源的入窖酒醅（S_2和S_4）在相對百分含量＞1%的揮發性成分的分布上差異明顯，酒醅S_4的主要揮發性成分種類多于S_2。經成對樣本t檢驗可知，酒醅S_2在乙醇、乳酸乙酯和乙酸的分布上顯著高于酒醅S_4（P=0.035＜0.05），在其他相對百分含量＞1%的揮發性成分的分布上顯著低于酒醅S_4（P=0.028＜0.05），說明不同來源的入窖酒醅在相對百分含量＞1%的揮發性成分上差異顯著。可見同種香型的白酒，雖然不同來源的入窖酒醅在揮發性成分分布上有較大差異，但這并不會顯著影響出窖酒醅中揮發性成分的分布。

圖4 不同酒醅中揮發性成分的分布Fig.4 Distribution of volatile compounds in different fermented grains

3 結論

濃香型白酒在采用同樣的原料、大曲和發酵工藝時，不同來源的出窖酒醅在揮發性成分的多樣性、香氣成分類別、主要揮發性成分分布上差異均不明顯。不同來源的入窖酒醅在揮發性成分多樣性上、香氣成分類別上有差異，在主要揮發性成分分布上差異顯著，但這種差異不足以改變出窖酒醅的揮發性成分。因此可以認為入窖酒醅的揮發性成分對出窖酒醅的揮發性成分不會產生顯著影響。本文研究成果能為濃香型白酒固態發酵的工藝控制提供一定參考。