UPLC-MS/MS同時檢測嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽和高氯酸鹽殘留

張立佳，胡 雪，文 靜，謝瑞龍，莫 楠，劉麗君，李翠枝

（內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010110）

高氯酸鹽（ClO4-）是一種公認的、有毒的、無機陰離子的持久性環境污染物，廣泛用于炸藥、煙花、火箭燃料的制造，從而使高氯酸鹽很容易釋放到環境中，導致水源、土壤、空氣全部被污染[1]。高氯酸可以競爭性結合利用鈉/碘轉運體（sodium iodide symporter，NIS），從而干擾人體正常新陳代謝，對人體健康有害，尤其是影響胎兒和嬰兒神經中樞的正常生長和發育[2]。美國環境保護署（environmental protection agency，EPA）將高氯酸鹽列入污染物候選名單（contaminant candidate list，CCL）[3]。2020年歐盟發布草案，關于嬰幼兒配方食品即食狀態下高氯酸鹽最大殘留限量為0.01 mg/kg[4]。隨著二氧化氯作為新一代高效消毒劑、水處理劑、漂白劑的廣泛使用[5]，氯酸鹽（ClO3-）作為主要副產物，能影響人體的甲狀腺系統和血液系統，并降低精子的數量和活力[6-7]。嬰幼兒配方奶粉中測出高氯酸鹽、氯酸鹽時有發生。有研究表明，對于嬰幼兒配方奶粉中的高氯酸鹽主要污染源來自牧場的飼料[8]，而氯酸鹽的污染主要來自工廠生產線的清潔消毒和奶牛飲用過度消毒的水源[9]。由于國家目前還未制定相關限量標準，但是對嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽和高氯酸鹽殘留進行監控有著重要的意義。

目前國內外測定高氯酸鹽和氯酸鹽常用的檢測方法有：離子色譜法[10-11]、離子色譜-質譜法[12-14]、液相色譜-高分辨質譜法[15]和液相色譜-三重四極桿串聯質譜法[16-25]。其中離子色譜法靈敏度較低，受其他陰離子干擾較大，尤其是嬰幼兒配方奶粉基質較復雜，進樣溶液中存在高濃度的氯離子、硫酸根離子、硝酸根離子等干擾離子，在分析柱上易過飽和而產生拖尾現象，影響高氯酸鹽的分析；離子色譜-質譜法對儀器穩定性要求極高，如離子色譜部分抑制器出現問題，存在高濃度的堿液進入質譜儀器，導致質譜儀器癱瘓的風險。液相色譜-高分辨質譜法成本較高，不適用于常規定量分析，主要應用于篩查和定性分析；液相色譜-串聯質譜法具有較強的抗基質干擾能力，靈敏度較高，主要應用于測定有機化合物和蛋白多肽，很少應用到無機離子的測定，隨著近幾年色譜技術的突出猛進，研發出一大批新型的色譜柱，讓過去的不能變為可能。

本研究采用一款新型的色譜柱，將其首次應用到高氯酸鹽和氯酸鹽分離，以期建立液相色譜-串聯質譜法同時測定嬰幼兒配方奶粉中高氯酸鹽和氯酸鹽的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Waters Anionic Polar Pesticide（2.1 mm×150 mm，5 μm）色譜柱、Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱、GHP濾膜（0.2 μm）：美國Waters公司；Thermo Acclaim TRINITY P1（50 mm×2.1 mm，3 μm）離子交換色譜柱：美國賽默飛公司。

氯酸根離子標液和高氯酸根離子標液（純度≥99.0%）：上海安譜實驗科技股份有限公司；氯酸根離子同位素內標（純度≥99.0%）：Cambridge Isotope Laboratories公司；氯酸根離子同位素內標（純度≥99.0%）：SOREAG公司；實驗室用水為Milli-Q超純水；乙腈（色譜純）：德國Meker公司；甲酸（質譜純）：天津市沃爾孚科技發展有限公司；甲酸銨（色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC TQ-S 超高效液相色譜-串聯質譜儀（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）（配有電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI））：美國Waters公司；3K 30高速離心機：德國Sigma公司；KS 501渦旋混合振蕩器：德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準中間溶液（10 μg/mL）的配制：分別準確吸取氯酸鹽和高氯酸鹽（1 mg/mL）標準儲備液0.1 mL至10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度線，混勻，0～4 ℃避光保存。

混合標準中間溶液（100 ng/mL）的配制：分別準確吸取氯酸鹽和高氯酸鹽混標中間液1 mL至100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度線，混勻，0～4 ℃避光保存。

混合高氯酸鹽和氯酸鹽同位素內標液（100 ng/mL和300 ng/mL）的配制：分別準確移取0.15 mL、0.1 mL同位素內標儲備液置于100.0 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配制成氯酸根-18O3離子、高氯酸根-18O4離子濃度分別為300ng/mL和100ng/mL的混合內標中間液，0～4℃避光保存。

準確吸取高氯酸鹽和氯酸鹽的混標中間液（100 ng/mL）和高氯酸鹽和氯酸鹽混合的內標中間液（100 ng/mL和300 ng/mL），用超純水稀釋，配制成質量濃度依次為0、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL的系列標準溶液，且系列標準溶液各濃度點中同位素內標氯酸根（ClO3-）18O3離子和高氯酸根（ClO4-）18O4離子質量濃度分別為15.0 ng/mL和5.0 ng/mL。以定量離子響應值為縱坐標，氯酸鹽、高氯酸鹽質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程。

1.3.2 樣品前處理

稱取試樣1 g（精確到0.000 1 g），置于50 mL具塞離心管中，加入750 μL高氯酸鹽和氯酸鹽的混合內標中間液（100 ng/mL），準確加入4.25 mL0.2%甲酸水溶液，渦旋混勻2 min，再準確加入10 mL乙腈，置于水平搖床振蕩提取10 min，10 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液，經乙腈飽和正己烷液液分配，除去脂肪，過0.22 μm的有機濾膜，備用，供液相色譜串聯質譜聯用儀測定。

1.3.3 液相色譜-串聯質譜條件

（1）液相色譜條件

Waters Anionic Polar Pesticide色譜柱（2.1 mm×150 mm，5 μm），流動相A為體積分數0.9%甲酸+50 mmoL甲酸銨水溶液，流動相B為乙腈；流速0.45 mL/min；柱溫50 ℃；進樣體積1 μL；線性梯度洗脫：0～4.0 min，90%B；4.0～4.5 min，90%～40%B；4.5～6.0 min，40%B；6.0～8.0 min，40%～90%B；8.0～12.0 min，90%B。

（2）質譜條件

電離模式：電噴霧離子源負離子（ESI-）模式；毛細管電壓3.5 kV；源溫150 ℃；脫溶劑溫度500 ℃；脫溶劑氣流量650 L/h；碰撞室氣流量0.18 mL/min；多反應監測模式檢測；其他質譜條件如表1所示。

表1 高氯酸鹽和氯酸鹽質譜參數Table 1 Mass spectrometry parameters of perchlorate and chlorate

2 結果與分析

2.1 前處理方法的選擇

2.1.1 提取試劑的選擇

由于高氯酸鹽和氯酸鹽作為陰離子化合物在水中具有較好的溶解性，并且水可以充分溶解奶粉樣品，有利于試樣中高氯酸鹽和氯酸鹽提取，同時陰離子化合物在水中加入一定量的甲酸，可以提高提取效率。因此本實驗選擇加入適量甲酸水溶液作為提取液。由于嬰幼兒配方奶粉中基質較復雜，如蛋白質、脂肪、碳水化合物和礦物質等均需要去除，研究了甲醇和乙腈體系對高氯酸鹽和氯酸鹽提取和凈化效果的差異，結果見圖1。由圖1可知，當加入同等體積的甲醇和乙腈，均可以有效的去除蛋白質等基體干擾，檢測結果并無顯著差異，但是連續數日后進樣發現，樣品過夜后會有大量白色固體析出，甲醇體系對儀器和色譜柱的污染較嚴重，乙腈體系對儀器的污染相對較小并且靜置數量日后無沉淀析出，因此選擇乙腈作為提取試劑。

圖1 不同溶劑凈化后溶液靜置析出情況（A：甲醇體系；B：乙腈體系）Fig.1 Static precipitation of the solution after purification with different solvents (A:methanol system;B:acetonitrile system)

2.2 質譜條件優化

根據氯酸鹽和高氯酸鹽化合物的性質，需要采用負離子模式。首先，對母離子進行全掃描，待測物響應準分子離子峰在負離子模式下獲得，母離子為[M-H]-，以準分子離子為母離子進行二級質譜掃描，得到各個化合物響應最佳的碎片離子。選擇母離子及對應產生的2個響應較強的子離子作為定性定量依據，完全滿足歐盟2002/657/EC指令[26]。

2.3 色譜條件優化

2.3.1 色譜柱的選擇

氯酸鹽和高氯酸鹽均為極性的離子型化合物，在反相色譜柱C18柱上無法保留。本研究主要考察了兩款色譜柱：Thermo Acclaim TRINITY P1色譜柱（3 μm，50 mm×2.1 mm）和Waters Anionic Polar Pesticide 色譜柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）。Thermo Acclaim TRINITY P1色譜柱是一款離子交換型色譜柱，其填料的鍵合相可提供陰陽離子交換和反相的功能；Waters Anionic Polar Pesticide 色譜柱主要用于分析陰離子農藥，通過兩步式鍵合工藝，以亞乙基橋雜化顆粒為基礎，鍵合二乙基胺，結合了Hilic和WAX雙重原理，使得該色譜柱具有更好的保留特性和選擇性。研究表明，通過對ThermoAcclaim TRINITY P1色譜柱條件的優化，可實現對高氯酸鹽和氯酸鹽的分離，但是存在著保留時間漂移，氯酸鹽受基質干擾較嚴重，靈敏度低，色譜柱壽命短等缺點；通過對Waters Anionic Polar Pesticide 色譜柱條件的優化，可實現對高氯酸鹽和氯酸鹽的分離，經過連續數日大量樣品的檢測，高氯酸鹽和氯酸鹽出峰時間較穩定，不受基質的干擾，尤其是氯酸鹽出峰時間后移，保證了氯酸鹽不受基質的干擾。在同等條件下，其靈敏度比Thermo Acclaim TRINITY P1色譜柱的靈敏度至少高10倍。因此，選擇Waters Anionic Polar Pesticide（2.1 mm×150 mm，5 μm）作為色譜柱。最后，研究了緩沖鹽體系色譜柱進樣前的平衡時間，當平衡時間低于120 min時，高氯酸鹽色譜峰會有分岔現象，甚至出現雙峰，氯酸鹽色譜變寬，靈敏度下降。因此，最終色譜柱進樣前平衡時間至少為120 min，否則儀器的靈敏度和色譜峰型都達不到最佳效果。

2.3.2 液相條件的優化

本研究主要考察了5種流動相體系，分別為20 mmol/L甲酸銨水溶液-乙腈（A）、50 mmol/L甲酸銨水溶液-乙腈（B）、0.9%甲酸+20 mmol/L甲酸銨水溶液-乙腈（C）、0.9%甲酸+50 mmol/L甲酸銨水溶液-乙腈（D）、0.9%甲酸+50 mmol/L甲酸銨水溶液-0.9%甲酸乙腈（E）。高氯酸鹽和氯酸鹽不同液相條件對靈敏度的影響見圖2。由圖2可知，流動相中甲酸和甲酸銨含量對氯酸鹽和高氯酸鹽的色譜保留能力以及色譜峰型均有較大的影響。當甲酸銨水溶液濃度低于50 mmol/L，氯酸鹽保留較弱，靈敏度較低；當甲酸銨水溶液中不添加甲酸，氯酸鹽和高氯酸鹽的靈敏度較低，色譜峰型較寬并有拖尾現象；當有機相中添加一定比例的甲酸會嚴重降低高氯酸鹽的靈敏度。因此，通過優化選擇0.9%甲酸+50 mmol/L甲酸銨水溶液-乙腈體系（D）作為流動相。通過對進樣量的優化，最終選擇1 μL為進樣體積，滿足方法的要求，同時有效的減少了樣品對儀器的污染。

圖2 高氯酸鹽和氯酸鹽不同液相條件對靈敏度的影響Fig.2 Effect of different liquid phase conditions on sensitivity of perchlorate and chlorate

2.4 基質效應

采用標準曲線比較法[23]，對嬰幼兒配方奶粉前處理方法的基質效應進行評估。標準曲線A：用超純水稀釋，制成含高氯酸鹽依次為0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L 的混合標準工作液，氯酸鹽依次為1 μg/L、2 μg/L、μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L。標準曲線B：用不含氯酸鹽和高氯酸鹽的嬰幼兒配方奶粉樣品，按照樣品前處理方法進行提取凈化，用凈化液配制同樣質量濃度的系列標準曲線。由基質效應（matrix effect，ME）=斜率B曲線/斜率A曲線×100%計算，得到氯酸鹽的ME為0.93%，高氯酸鹽的ME為0.68%。結果顯示，奶粉樣品的基質效應為基質抑制，因此采用外標法定量存在誤差。采用同位素內標法，同位素內標與待測目標物的色譜和質譜行為相近，可以補償氯酸鹽和高氯酸鹽因基質效應影響引起的響應變化，以解決因基質效應造成定量不準的問題。

2.5 標準曲線和定量限

由表2可知，高氯酸鹽和氯酸鹽添加量為7.5～75.0 μg/kg和15～150 μg/kg時，線性關系均良好，標準曲線相關系數（R2）均大于0.99，定量限分別為7.5 μg/kg和15.0 μg/kg，可以滿足定量分析的需要。

表2 高氯酸鹽和氯酸鹽的線性范圍、線性方程、相關系數及定量限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficient and quantitative limits of perchlorate and chlorate

2.6 方法回收率與精密度

通過篩選，在牛乳基嬰幼兒配方奶粉和羊乳基嬰幼兒配方奶粉兩種基質空白樣品上進行1倍定量限、2 倍定量限、10 倍定量限3個不同濃度水平加標實驗，每個水平做6平行，計算每個濃度點6個平行的測定值的平均回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），具體的精密度與回收率實驗結果見表3。由表3可知，精密度試驗結果RSD在2.0%～8.7%之間，平均回收率范圍為82.50%～98.5%。方法學結果表明，回收率及精密度均能達到分析測定的要求。

表3 方法回收率和精密度Table 3 Recovery and precision of the method

2.7 實際樣品測定

利用本研究建立的方法對10批次市售的嬰幼兒配方奶粉進行檢測，氯酸鹽檢出4批，含量范圍在15～43 μg/kg之間。高氯酸鹽檢出7批，含量范圍為7.5～33.0 μg/kg。

3 結論

采用UPLC-MS/MS法同時測定串聯質譜法同時檢測嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽和高氯酸鹽殘留，嬰幼兒配方乳粉氯酸鹽和高氯酸的定量限均為7.5 μg/kg和15.0 μg/kg，高氯酸鹽和氯酸鹽分別在7.5 μg/kg、15.0 μg/kg、75.0 μg/kg和15.0 μg/kg、30.0 μg/kg、150.0 μg/kg 3個水平下的加標回收率為82.5%～98.5%，精密度試驗結果的相對標準偏差為2.0%～8.7%（n=6）；該方法穩定、準確、靈敏度高，可用于嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽和高氯酸鹽殘留量檢測。