基于Discovery Studio軟件的專業(yè)學(xué)位CADD研究生課程教學(xué)案例設(shè)計
——抗新冠肺炎中藥有效成分山奈酚與靶蛋白的分子對接

張永紅，蔣啟華，李 艷

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016：2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016）

中藥有效成分及天然藥物分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)與藥效或生理活性之間的關(guān)系，是天然藥物研究的主要內(nèi)容之一。分子層面上，化學(xué)結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)；無論是天然藥物小分子或是中藥有效成分小分子，它們的分子大小、外形、化學(xué)反應(yīng)性、官能團(tuán)分布和立體構(gòu)型等都需要與與機體細(xì)胞上的靶受體相結(jié)合而發(fā)揮藥效。酶作為一種維持生命活動的重要催化劑，其功能和許多疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，因此也通常是非常重要的藥物研發(fā)的有效作用靶點。新冠疫情出現(xiàn)后，大量相關(guān)蛋白酶抑制劑藥物研究提上日程，如，與病毒復(fù)制轉(zhuǎn)染相關(guān)的3CL水解酶（3CLpro）、木瓜樣蛋白酶（PLpro）、以及和觸突蛋白結(jié)合的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE2）等。一直以來，分子對接方法對藥物小分子和靶蛋白的作用機制進(jìn)行研究是計算機輔助藥物設(shè)計（Computer Aided Drug Design，CADD）課程教學(xué)的重點內(nèi)容之一［1］。深入探討藥物作用機制，有助研究生學(xué)習(xí)掌握藥物分子結(jié)構(gòu)特征，理解受體配體互作關(guān)系，提升學(xué)習(xí)興趣。傳統(tǒng)教學(xué)手段難以形象展示藥物和靶蛋白的詳細(xì)結(jié)構(gòu)和具體作用機制，而以往的開源軟件DOCK和AUTODOCK等操作復(fù)雜，需要學(xué)生掌握大量計算機基礎(chǔ)知識，都不利于學(xué)生認(rèn)識和掌握相關(guān)知識。

隨著計算機計算功能增強，計算軟件普及，計算機輔助藥物分析已經(jīng)成為藥學(xué)研究的重要手段之一。計算機輔助藥物分析中，分子對接最常用于研究小分子與大分子相互作用模式，尤其是天然藥物分子與受體蛋白的作用，分子對接能很好地直觀展現(xiàn)，作為CADD課程中主要內(nèi)容之一，分子對接知識點的學(xué)習(xí)是一個重點。結(jié)合科研工作實踐，本文探索基于Discovery Studio（簡稱DS）分子模擬軟件平臺可視化、高質(zhì)量的三維結(jié)構(gòu)展示功能和分子對接模塊，設(shè)計了中藥小分子山奈酚與3CL水解酶的分子對接實驗，讓學(xué)生通過分子對接模擬過程，認(rèn)識天然藥物分子結(jié)構(gòu)特征，理解構(gòu)效關(guān)系特征，獲知酶抑制劑和靶蛋白的作用機制，了解和熟練掌握CADD應(yīng)用于中藥材和天然藥物研發(fā)與藥效分析的應(yīng)用方法。

1 課程實驗選題的依據(jù)和思考

分子對接技術(shù)是專業(yè)學(xué)位研究生CADD課程教學(xué)的主要教學(xué)知識點之一。2020級CADD教學(xué)開始以抗新型冠狀病毒藥物研發(fā)周期來展開CADD教學(xué)示例，因此，對于與病毒復(fù)制轉(zhuǎn)染相關(guān)的3CL水解酶（3CLpro）、木瓜樣蛋白酶（PLpro）、以及和觸突蛋白結(jié)合的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE2）作為抗冠狀病毒藥物研發(fā)的三個重要靶點［2-3］，3CLpro 和 PLpro是兩種在復(fù)制和包裝新一代病毒過程中起作用的蛋白酶，而細(xì)胞表面的ACE2受體讓棘突S蛋白有機會與其結(jié)合，從而入侵細(xì)胞，這三個靶蛋白酶的活性受到抑制都可能導(dǎo)致病毒在體內(nèi)的復(fù)制轉(zhuǎn)染受阻，從而起到預(yù)防和治療新冠的效果，因此三者目前是常用的抗新冠藥物研發(fā)重點考慮的作用靶點。

另一方面，山奈酚，又名百蕊草素Ⅲ，屬于黃酮類化合物，作為目前文獻(xiàn)報道的網(wǎng)絡(luò)藥理分析出來多種中藥復(fù)方中常見的有效成分小分子，在20多種復(fù)方中，都作為有效成分出現(xiàn)，文獻(xiàn)報道顯示山奈酚既能作為ACE2抑制劑也能作為3CLpro抑制劑，與ACE2和3CLpro都有明確的相互作用［4-5］。且二者結(jié)構(gòu)都已經(jīng)得到解析，在PDB庫中都能找到合適的高清晶體結(jié)構(gòu)。針對上述問題，從而考慮利用DS分子模擬軟件的分子對接功能，設(shè)計山奈酚與3CLpro分子對接的研究生CADD課程實驗。

分子對接實驗可用于輔助CADD教學(xué)，能形象展示構(gòu)效關(guān)系，可作為教學(xué)演示，提升教學(xué)效果；也可作為藥物設(shè)計相關(guān)課程上機實驗或DS軟件基本教學(xué)操作。通過讓學(xué)生參與本實驗，首先能了解山奈酚分子結(jié)構(gòu)特征，熟悉DS軟件分子對接的操作步驟，能利用分子對接方法掌握山奈酚與3CLpro之間相互作用關(guān)系，同時，熟悉3CLpro抑制劑的構(gòu)效關(guān)系，進(jìn)而加深基于靶蛋白的藥物設(shè)計理念，學(xué)好CADD一課。

2 實驗內(nèi)容設(shè)計及實驗操作步驟

DS是BIOVIA公司集成的一款可視化程度高的面向生命科學(xué)研究領(lǐng)域的商業(yè)軟件，重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院已購買部分版權(quán)，其中包括配體與受體相互作用模塊。該模塊集成了快速篩選對接模塊如LibDock和GOLD，以及對接優(yōu)化模塊CDOCKER和In Situ Ligand Minimization等不同類型分子對接的小模塊。其中CDOCKER模塊適合于小分子與靶蛋白酶的精確對接，該模塊采用高溫動力學(xué)方法隨機搜索配體分子構(gòu)象，再模擬退火將這些構(gòu)象在受體活性位點區(qū)域進(jìn)行優(yōu)化并打分排序，在此基礎(chǔ)上獲得相對結(jié)合穩(wěn)定的對接結(jié)果。目前，DS可適應(yīng)于Windows/Unix等操作系統(tǒng)，同時擁有可視化友好操作界面，便于演示和讓學(xué)生操作。因此，CADD課程選用DS中CDOCKER模塊利用分子對接方法模擬中藥小分子山奈酚（kaempferol）與3CL水解酶（3CLpro）的相互作用。具體實驗步驟及實驗內(nèi)容如下。

2.1 靶蛋白結(jié)構(gòu)的載入和受體配體文件預(yù)處理

靶蛋白結(jié)構(gòu)如果在PDB數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)存在所需的受體配體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)可直接下載后，通過補充氨基酸殘基、蛋白加氫等預(yù)處理后，用于分子對接中作為受體使用。由上海科技大學(xué)饒子和/楊海濤課題組測定的2019-nCoV冠狀病毒3CL水解酶（Mpro）的高分率晶體結(jié)構(gòu)于2020年1月26日被首次報道，晶體結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)可到PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）下載（PDB ID：6LU7）。該團(tuán)隊通過計算機輔助藥物設(shè)計鑒定了基于機理的抑制劑N3，隨后確定了與該化合物復(fù)合的COVID-19病毒Mpro的晶體結(jié)構(gòu)。受體/配體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：6LU7）詮釋了抑制劑和受體之間的作用位點和作用方式。

蛋白文件具體DS平臺操作流程如下：第一步，蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)載入的步驟為：File→Open URL→ID：6LU7（輸入蛋白PDBID號）。第二步，蛋白文件預(yù)處理：在左側(cè)窗口中刪除water和ligand groups中除N3的其他配體（僅保留配體N3），依次點擊Tools→Macromolecules→prepare protein→clean protein（補充非完整的氨基酸殘基，為蛋白加氫等。結(jié)果如圖1所示蛋白文件處理。第三步，受體Binding Site結(jié)合位點定義：由于PDB結(jié)構(gòu)為配體/受體復(fù)合物，可以按以下步驟定義活性位點：Tools→Receptor-Ligand Interactions→Define and Edit Binding Site→選中配體N3→From Current selection；然后刪除N3，完成活性位點的定義。這種定義結(jié)合位點的方法是從現(xiàn)有配體的位置來定義，蛋白上此部位對結(jié)合的貢獻(xiàn)可能相對比較大，也可以自定義坐標(biāo)來進(jìn)行結(jié)合位點設(shè)定，只是貢獻(xiàn)可能性與已有配體出發(fā)的位點貢獻(xiàn)會存在差別。

Figure 1 Receptor-ligand complex（6LU7） structure（a.complex downloaded from PDB；b.complex deal with dehydration and adding hydrogen）圖1 6LU7受體配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)載入與預(yù)處理圖（a.PDB庫下載得結(jié)構(gòu)；b.去水加氫處理后）

配體小分子結(jié)構(gòu)可以直接在DS平臺新的小分子窗口構(gòu)建或通過其他軟件繪制等方式獲得。預(yù)處理流程為：將畫好的小分子三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)入，如山奈酚：kaempferol，再依次點擊：Tools→Receptor-Ligand Interactions→Dock ligands→Prepare ligands。即處理好了小分子，并能得到不同空間可能的柔性小分子文件。

2.2 基于CDOCKER模塊的分子對接模擬

依次點擊：Tools→Receptor-Ligand Interactions→Dock ligands→Dock optimization→Dock ligands（CDOCKER）。在彈出的選擇窗口中，Input Receptor選擇處理好并定義好結(jié)合位點的6LU7，Input ligands選項選擇Molecules：ALL（預(yù)處理完成的配體的文件名，如山奈酚：kaempferol）；因為結(jié)合位點已經(jīng)選擇好，結(jié)合中參數(shù)可以都選定為默認(rèn)值也可以根據(jù)自己實驗需要進(jìn)行參數(shù)設(shè)定，比如最優(yōu)結(jié)果顯示默認(rèn)10，最后就會顯示出10個結(jié)合最優(yōu)的模式；然后點擊Run。待程序運行完后，即可獲得相關(guān)結(jié)果。

2.3 分子對接結(jié)果可靠性分析

將對接獲得的分子構(gòu)象和從6LU7中提出的N3分子構(gòu)象放入同一分子窗口。將晶體中的N3構(gòu)象設(shè)置為參考結(jié)構(gòu)，進(jìn)行RMSD分析。先選中晶體的N3分子，點structrue/RMSD/set reference，再選全部分子，點structure/RMSD/Heavy atoms，得出分子對接結(jié)果與原配體分子的RMSD值。分子對接打分最高的分子構(gòu)象的RMSD值為所有構(gòu)象中最小值，說明對接結(jié)果有良好可靠性。

2.4 分子對接結(jié)果分析

對于分子對接結(jié)果，通常綜合考慮RMSD分析結(jié)果和對接打分值，可以選擇-CDOCKER_ENERGY得分值最高的構(gòu)象為最佳結(jié)合構(gòu)象，進(jìn)行分析，有時候綜合考慮-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY得分值，兩個值都需要高分評為較好構(gòu)象進(jìn)行分析。

選擇-CDOCKER_ENERGY得分值最高的構(gòu)象，從Tools窗口，依次打開Tools→Receptor-Ligand Interactions→View Interaction Ligands可以觀察受體配體之間的相互作用，同時可考察受體的疏水、溶劑可及、電荷、氫鍵或離子化表面等狀態(tài)。6LU7與kaempferol對接結(jié)果如圖2所示。

Figure 2 Results analyses of 6LU7-kaempferol complex （a.6LU7-kaempferol complex；b.6LU7-kaempferol interaction；c.Hydrophobic surface interaction；d.2D diagram）圖2 6LU7與kaempferol對接結(jié)果分析圖（a.6LU7-kaempferol結(jié)合圖；b.6 LU7kaempferol相互作用展示圖；c.hydrophobic表面展示圖 d.二維結(jié)果分析圖）

從圖2可以清晰地看到山奈酚和6LU7的相互作用情況。首先從圖2可對非鍵相互作用直觀顯示與分析，在視圖窗口中如圖2b，c，d，受體蛋白氨基酸殘基與配體對接poses間的非鍵相互作用會通過不同顏色的虛線顯示出來，且只有參與了同配體之間的相互作用的殘基才會顯示。另一方面，在DS平臺中，展開Receptor-Ligand Interactions/View Interactions，點擊Show 2D Diagram。可以看到在一新窗口中打開配體-蛋白相互作用二維平面圖，生成山奈酚和6LU7相互作用二維平面圖如圖2d，便于我們更直觀的觀察兩者的相互作用及關(guān)鍵的氨基酸和基團(tuán)。

對于3CL水解酶6LU7，對接結(jié)果從圖中可以看出，CYS145 會與kaempferol苯環(huán)上的離域π鍵產(chǎn)生疏水作用，其中CYS145中巰基上的S原子會與kaempferol苯環(huán)的離域π鍵產(chǎn)生疏水作用（Pi-Sulfur），而CYS145中的烷基會與含氧環(huán)上的π鍵產(chǎn)生作用（Pi-Alkyl），同時，CYS145中HN會與氧形成分子間氫鍵（Hydrogen bond）。同時，GLY143和SER144都是氨基酸殘基上的HN與kaempferol形成氫鍵，而PHE140和THR26是氨基酸殘基上的O與kaempferol形成氫鍵（Hydrogen bond）。這些作用位點是分子構(gòu)效關(guān)系研究和分子結(jié)構(gòu)改造過程中需要考慮的因素。

另外，受體的表面展示圖，考慮到疏水作用在二者間相互作用里占一定比例，我們選用疏水表面如圖2c所示。山奈酚分子中酚羥基與鄰近環(huán)上C=O中氧原子形成分子內(nèi)氫鍵，導(dǎo)致分子剛性平面增強，局部極性降低，當(dāng)與結(jié)合時主要在受體的非極性表面（顏色偏淺色而不是藍(lán)色區(qū)域）進(jìn)行結(jié)合。在新藥分子設(shè)計過程中可以結(jié)合空腔的分子親疏水表面情況在該部位優(yōu)化分子片段，以設(shè)計新型藥物分子。

3 討 論

通過采用天然藥物分子山奈酚與新冠病毒復(fù)制轉(zhuǎn)染相關(guān)的3CL水解酶進(jìn)行分子對接實驗內(nèi)容設(shè)計及具體實驗操作步驟講解，從6LU7與kaempferol分子對接流程和對接結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)分析，可以讓研究生CADD課程的教授與學(xué)習(xí)從以下幾方面得到啟發(fā)。

6LU7-N3復(fù)合物的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)獲得，便于對接結(jié)果與晶體復(fù)合物進(jìn)行比對，以檢驗分子對接的可靠性。對接模擬結(jié)果很好地展示天然藥物小分子kaempferol與3CL水解酶6LU7之間的作用模式。對接結(jié)果和復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)一致性分析，可用來分析天然藥物小分子的分子構(gòu)效關(guān)系，可用于CADD課程的輔助教學(xué)，解釋基于受體的藥物設(shè)計。

6LU7-kaempferol分子對接涉及到6LU7蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)處理，kaempferol分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和預(yù)處理、CDOCKER對接和對接結(jié)果具體分析，能完整展現(xiàn)分子對接全模擬過程。方便研究生自行于DS平臺進(jìn)行分子對接學(xué)習(xí)和具體上機操作，可作為CADD課程中分子對接知識點的一個完整教學(xué)案例。

隨著互聯(lián)網(wǎng)+和計算機硬件技術(shù)的飛速發(fā)展，CADD相關(guān)計算軟件，如Molsoft，Gauss，Sybyl和DS等，可視化程度越來越直觀、操作越來越大眾、簡便的應(yīng)用在藥物分子性質(zhì)研究和新藥設(shè)計中［6］。將DS軟件引入研究生CADD課程教學(xué)中，可以形象展示受體蛋白的空間結(jié)構(gòu)、受體配體作用方式、受體配體表面等特征，有利于提升教學(xué)效果；同時讓專業(yè)學(xué)位研究生獲得一種直觀快速了解天然藥物小分子與靶蛋白相互作用的工具，為其課題研究提供一定的輔助分析方法支撐。

將獲得的分子對接模擬結(jié)果和晶體復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，如果分子對接結(jié)果與復(fù)合物結(jié)構(gòu)高度一致，則此天然藥物小分子抑制劑作為藥物研發(fā)對象有一定可行性，否則，抑制劑可能不一定可靠。分子對接中Kaempferol與受體氨基酸殘基的形成較強的分子間氫鍵，且部分區(qū)域明顯存在疏水作用，這些作用位點可能是山奈酚產(chǎn)生生理作用的關(guān)鍵位點。這些位點理論上來說也是3CL水解酶抑制劑開發(fā)中對于構(gòu)效關(guān)系，應(yīng)重點考慮的分子結(jié)構(gòu)因素。這種分析思路的訓(xùn)練，利于培養(yǎng)專業(yè)學(xué)位研究生對天然藥物結(jié)構(gòu)改造的科研思維，使其能對藥物設(shè)計理念進(jìn)一步深入。

基于DS模擬平臺為藥學(xué)專業(yè)學(xué)位研究生CADD課程教學(xué)引入了天然藥物小分子與2019-nCoV冠狀病毒3CL水解酶的分子對接教學(xué)演示和操作練習(xí)實驗。本案例包含了靶蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)處理、藥物分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)建、分子對接和結(jié)果分析等實驗內(nèi)容。通過分子對接案例演示，讓研究生學(xué)習(xí)和演練完整的分子對接模擬過程，掌握天然藥物小分子結(jié)構(gòu)特征，理解構(gòu)效關(guān)系特性，學(xué)會分析靶酶抑制劑和靶蛋白酶的作用機制，掌握天然藥物分子層面的CADD研究方法，為自己的科學(xué)研究問題提供一種新思路。本案例已作為研究生課程教學(xué)，教學(xué)效果將進(jìn)一步總結(jié)和分析。