基于Discovery Studio軟件的專業學位CADD研究生課程教學案例設計
——抗新冠肺炎中藥有效成分山奈酚與靶蛋白的分子對接

張永紅，蔣啟華，李 艷

（1.重慶醫科大學藥學院，重慶 400016：2.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 400016）

中藥有效成分及天然藥物分子的化學結構與藥效或生理活性之間的關系，是天然藥物研究的主要內容之一。分子層面上，化學結構決定性質；無論是天然藥物小分子或是中藥有效成分小分子，它們的分子大小、外形、化學反應性、官能團分布和立體構型等都需要與與機體細胞上的靶受體相結合而發揮藥效。酶作為一種維持生命活動的重要催化劑，其功能和許多疾病的發生發展相關，因此也通常是非常重要的藥物研發的有效作用靶點。新冠疫情出現后，大量相關蛋白酶抑制劑藥物研究提上日程，如，與病毒復制轉染相關的3CL水解酶（3CLpro）、木瓜樣蛋白酶（PLpro）、以及和觸突蛋白結合的血管緊張素轉化酶（ACE2）等。一直以來，分子對接方法對藥物小分子和靶蛋白的作用機制進行研究是計算機輔助藥物設計（Computer Aided Drug Design，CADD）課程教學的重點內容之一［1］。深入探討藥物作用機制，有助研究生學習掌握藥物分子結構特征，理解受體配體互作關系，提升學習興趣。傳統教學手段難以形象展示藥物和靶蛋白的詳細結構和具體作用機制，而以往的開源軟件DOCK和AUTODOCK等操作復雜，需要學生掌握大量計算機基礎知識，都不利于學生認識和掌握相關知識。

隨著計算機計算功能增強，計算軟件普及，計算機輔助藥物分析已經成為藥學研究的重要手段之一。計算機輔助藥物分析中，分子對接最常用于研究小分子與大分子相互作用模式，尤其是天然藥物分子與受體蛋白的作用，分子對接能很好地直觀展現，作為CADD課程中主要內容之一，分子對接知識點的學習是一個重點。結合科研工作實踐，本文探索基于Discovery Studio（簡稱DS）分子模擬軟件平臺可視化、高質量的三維結構展示功能和分子對接模塊，設計了中藥小分子山奈酚與3CL水解酶的分子對接實驗，讓學生通過分子對接模擬過程，認識天然藥物分子結構特征，理解構效關系特征，獲知酶抑制劑和靶蛋白的作用機制，了解和熟練掌握CADD應用于中藥材和天然藥物研發與藥效分析的應用方法。

1 課程實驗選題的依據和思考

分子對接技術是專業學位研究生CADD課程教學的主要教學知識點之一。2020級CADD教學開始以抗新型冠狀病毒藥物研發周期來展開CADD教學示例，因此，對于與病毒復制轉染相關的3CL水解酶（3CLpro）、木瓜樣蛋白酶（PLpro）、以及和觸突蛋白結合的血管緊張素轉化酶（ACE2）作為抗冠狀病毒藥物研發的三個重要靶點［2-3］，3CLpro 和 PLpro是兩種在復制和包裝新一代病毒過程中起作用的蛋白酶，而細胞表面的ACE2受體讓棘突S蛋白有機會與其結合，從而入侵細胞，這三個靶蛋白酶的活性受到抑制都可能導致病毒在體內的復制轉染受阻，從而起到預防和治療新冠的效果，因此三者目前是常用的抗新冠藥物研發重點考慮的作用靶點。

另一方面，山奈酚，又名百蕊草素Ⅲ，屬于黃酮類化合物，作為目前文獻報道的網絡藥理分析出來多種中藥復方中常見的有效成分小分子，在20多種復方中，都作為有效成分出現，文獻報道顯示山奈酚既能作為ACE2抑制劑也能作為3CLpro抑制劑，與ACE2和3CLpro都有明確的相互作用［4-5］。且二者結構都已經得到解析，在PDB庫中都能找到合適的高清晶體結構。針對上述問題，從而考慮利用DS分子模擬軟件的分子對接功能，設計山奈酚與3CLpro分子對接的研究生CADD課程實驗。

分子對接實驗可用于輔助CADD教學，能形象展示構效關系，可作為教學演示，提升教學效果；也可作為藥物設計相關課程上機實驗或DS軟件基本教學操作。通過讓學生參與本實驗，首先能了解山奈酚分子結構特征，熟悉DS軟件分子對接的操作步驟，能利用分子對接方法掌握山奈酚與3CLpro之間相互作用關系，同時，熟悉3CLpro抑制劑的構效關系，進而加深基于靶蛋白的藥物設計理念，學好CADD一課。

2 實驗內容設計及實驗操作步驟

DS是BIOVIA公司集成的一款可視化程度高的面向生命科學研究領域的商業軟件，重慶醫科大學藥學院已購買部分版權，其中包括配體與受體相互作用模塊。該模塊集成了快速篩選對接模塊如LibDock和GOLD，以及對接優化模塊CDOCKER和In Situ Ligand Minimization等不同類型分子對接的小模塊。其中CDOCKER模塊適合于小分子與靶蛋白酶的精確對接，該模塊采用高溫動力學方法隨機搜索配體分子構象，再模擬退火將這些構象在受體活性位點區域進行優化并打分排序，在此基礎上獲得相對結合穩定的對接結果。目前，DS可適應于Windows/Unix等操作系統，同時擁有可視化友好操作界面，便于演示和讓學生操作。因此，CADD課程選用DS中CDOCKER模塊利用分子對接方法模擬中藥小分子山奈酚（kaempferol）與3CL水解酶（3CLpro）的相互作用。具體實驗步驟及實驗內容如下。

2.1 靶蛋白結構的載入和受體配體文件預處理

靶蛋白結構如果在PDB數據庫中已經存在所需的受體配體復合物晶體結構，結構可直接下載后，通過補充氨基酸殘基、蛋白加氫等預處理后，用于分子對接中作為受體使用。由上海科技大學饒子和/楊海濤課題組測定的2019-nCoV冠狀病毒3CL水解酶（Mpro）的高分率晶體結構于2020年1月26日被首次報道，晶體結構的坐標可到PDB蛋白質結構數據庫（Protein Data Bank，PDB）下載（PDB ID：6LU7）。該團隊通過計算機輔助藥物設計鑒定了基于機理的抑制劑N3，隨后確定了與該化合物復合的COVID-19病毒Mpro的晶體結構。受體/配體復合物的晶體結構（PDB ID：6LU7）詮釋了抑制劑和受體之間的作用位點和作用方式。

蛋白文件具體DS平臺操作流程如下：第一步，蛋白復合物結構載入的步驟為：File→Open URL→ID：6LU7（輸入蛋白PDBID號）。第二步，蛋白文件預處理：在左側窗口中刪除water和ligand groups中除N3的其他配體（僅保留配體N3），依次點擊Tools→Macromolecules→prepare protein→clean protein（補充非完整的氨基酸殘基，為蛋白加氫等。結果如圖1所示蛋白文件處理。第三步，受體Binding Site結合位點定義：由于PDB結構為配體/受體復合物，可以按以下步驟定義活性位點：Tools→Receptor-Ligand Interactions→Define and Edit Binding Site→選中配體N3→From Current selection；然后刪除N3，完成活性位點的定義。這種定義結合位點的方法是從現有配體的位置來定義，蛋白上此部位對結合的貢獻可能相對比較大，也可以自定義坐標來進行結合位點設定，只是貢獻可能性與已有配體出發的位點貢獻會存在差別。

Figure 1 Receptor-ligand complex（6LU7） structure（a.complex downloaded from PDB；b.complex deal with dehydration and adding hydrogen）圖1 6LU7受體配體復合物結構載入與預處理圖（a.PDB庫下載得結構；b.去水加氫處理后）

配體小分子結構可以直接在DS平臺新的小分子窗口構建或通過其他軟件繪制等方式獲得。預處理流程為：將畫好的小分子三維結構導入，如山奈酚：kaempferol，再依次點擊：Tools→Receptor-Ligand Interactions→Dock ligands→Prepare ligands。即處理好了小分子，并能得到不同空間可能的柔性小分子文件。

2.2 基于CDOCKER模塊的分子對接模擬

依次點擊：Tools→Receptor-Ligand Interactions→Dock ligands→Dock optimization→Dock ligands（CDOCKER）。在彈出的選擇窗口中，Input Receptor選擇處理好并定義好結合位點的6LU7，Input ligands選項選擇Molecules：ALL（預處理完成的配體的文件名，如山奈酚：kaempferol）；因為結合位點已經選擇好，結合中參數可以都選定為默認值也可以根據自己實驗需要進行參數設定，比如最優結果顯示默認10，最后就會顯示出10個結合最優的模式；然后點擊Run。待程序運行完后，即可獲得相關結果。

2.3 分子對接結果可靠性分析

將對接獲得的分子構象和從6LU7中提出的N3分子構象放入同一分子窗口。將晶體中的N3構象設置為參考結構，進行RMSD分析。先選中晶體的N3分子，點structrue/RMSD/set reference，再選全部分子，點structure/RMSD/Heavy atoms，得出分子對接結果與原配體分子的RMSD值。分子對接打分最高的分子構象的RMSD值為所有構象中最小值，說明對接結果有良好可靠性。

2.4 分子對接結果分析

對于分子對接結果，通常綜合考慮RMSD分析結果和對接打分值，可以選擇-CDOCKER_ENERGY得分值最高的構象為最佳結合構象，進行分析，有時候綜合考慮-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY得分值，兩個值都需要高分評為較好構象進行分析。

選擇-CDOCKER_ENERGY得分值最高的構象，從Tools窗口，依次打開Tools→Receptor-Ligand Interactions→View Interaction Ligands可以觀察受體配體之間的相互作用，同時可考察受體的疏水、溶劑可及、電荷、氫鍵或離子化表面等狀態。6LU7與kaempferol對接結果如圖2所示。

Figure 2 Results analyses of 6LU7-kaempferol complex （a.6LU7-kaempferol complex；b.6LU7-kaempferol interaction；c.Hydrophobic surface interaction；d.2D diagram）圖2 6LU7與kaempferol對接結果分析圖（a.6LU7-kaempferol結合圖；b.6 LU7kaempferol相互作用展示圖；c.hydrophobic表面展示圖 d.二維結果分析圖）

從圖2可以清晰地看到山奈酚和6LU7的相互作用情況。首先從圖2可對非鍵相互作用直觀顯示與分析，在視圖窗口中如圖2b，c，d，受體蛋白氨基酸殘基與配體對接poses間的非鍵相互作用會通過不同顏色的虛線顯示出來，且只有參與了同配體之間的相互作用的殘基才會顯示。另一方面，在DS平臺中，展開Receptor-Ligand Interactions/View Interactions，點擊Show 2D Diagram。可以看到在一新窗口中打開配體-蛋白相互作用二維平面圖，生成山奈酚和6LU7相互作用二維平面圖如圖2d，便于我們更直觀的觀察兩者的相互作用及關鍵的氨基酸和基團。

對于3CL水解酶6LU7，對接結果從圖中可以看出，CYS145 會與kaempferol苯環上的離域π鍵產生疏水作用，其中CYS145中巰基上的S原子會與kaempferol苯環的離域π鍵產生疏水作用（Pi-Sulfur），而CYS145中的烷基會與含氧環上的π鍵產生作用（Pi-Alkyl），同時，CYS145中HN會與氧形成分子間氫鍵（Hydrogen bond）。同時，GLY143和SER144都是氨基酸殘基上的HN與kaempferol形成氫鍵，而PHE140和THR26是氨基酸殘基上的O與kaempferol形成氫鍵（Hydrogen bond）。這些作用位點是分子構效關系研究和分子結構改造過程中需要考慮的因素。

另外，受體的表面展示圖，考慮到疏水作用在二者間相互作用里占一定比例，我們選用疏水表面如圖2c所示。山奈酚分子中酚羥基與鄰近環上C=O中氧原子形成分子內氫鍵，導致分子剛性平面增強，局部極性降低，當與結合時主要在受體的非極性表面（顏色偏淺色而不是藍色區域）進行結合。在新藥分子設計過程中可以結合空腔的分子親疏水表面情況在該部位優化分子片段，以設計新型藥物分子。

3 討 論

通過采用天然藥物分子山奈酚與新冠病毒復制轉染相關的3CL水解酶進行分子對接實驗內容設計及具體實驗操作步驟講解，從6LU7與kaempferol分子對接流程和對接結果進行詳細分析，可以讓研究生CADD課程的教授與學習從以下幾方面得到啟發。

6LU7-N3復合物的高分辨率晶體結構已經獲得，便于對接結果與晶體復合物進行比對，以檢驗分子對接的可靠性。對接模擬結果很好地展示天然藥物小分子kaempferol與3CL水解酶6LU7之間的作用模式。對接結果和復合物晶體結構一致性分析，可用來分析天然藥物小分子的分子構效關系，可用于CADD課程的輔助教學，解釋基于受體的藥物設計。

6LU7-kaempferol分子對接涉及到6LU7蛋白結構的預處理，kaempferol分子結構的構建和預處理、CDOCKER對接和對接結果具體分析，能完整展現分子對接全模擬過程。方便研究生自行于DS平臺進行分子對接學習和具體上機操作，可作為CADD課程中分子對接知識點的一個完整教學案例。

隨著互聯網+和計算機硬件技術的飛速發展，CADD相關計算軟件，如Molsoft，Gauss，Sybyl和DS等，可視化程度越來越直觀、操作越來越大眾、簡便的應用在藥物分子性質研究和新藥設計中［6］。將DS軟件引入研究生CADD課程教學中，可以形象展示受體蛋白的空間結構、受體配體作用方式、受體配體表面等特征，有利于提升教學效果；同時讓專業學位研究生獲得一種直觀快速了解天然藥物小分子與靶蛋白相互作用的工具，為其課題研究提供一定的輔助分析方法支撐。

將獲得的分子對接模擬結果和晶體復合物結構進行比對，如果分子對接結果與復合物結構高度一致，則此天然藥物小分子抑制劑作為藥物研發對象有一定可行性，否則，抑制劑可能不一定可靠。分子對接中Kaempferol與受體氨基酸殘基的形成較強的分子間氫鍵，且部分區域明顯存在疏水作用，這些作用位點可能是山奈酚產生生理作用的關鍵位點。這些位點理論上來說也是3CL水解酶抑制劑開發中對于構效關系，應重點考慮的分子結構因素。這種分析思路的訓練，利于培養專業學位研究生對天然藥物結構改造的科研思維，使其能對藥物設計理念進一步深入。

基于DS模擬平臺為藥學專業學位研究生CADD課程教學引入了天然藥物小分子與2019-nCoV冠狀病毒3CL水解酶的分子對接教學演示和操作練習實驗。本案例包含了靶蛋白結構的預處理、藥物分子結構的構建、分子對接和結果分析等實驗內容。通過分子對接案例演示，讓研究生學習和演練完整的分子對接模擬過程，掌握天然藥物小分子結構特征，理解構效關系特性，學會分析靶酶抑制劑和靶蛋白酶的作用機制，掌握天然藥物分子層面的CADD研究方法，為自己的科學研究問題提供一種新思路。本案例已作為研究生課程教學，教學效果將進一步總結和分析。