IL-15Rα及RUNX2基因多態性與內蒙古地區蒙古族后縱韌帶骨化的相關性研究

李鵬飛，朱淑芬

(內蒙古自治區人民醫院脊柱外科，內蒙古 呼和浩特 010017)

隨著年齡增長，在眾多因素作用下，后縱韌帶組織中新生異位骨結構形成而逐漸發生骨化，導致椎管、椎間孔狹窄，壓迫脊髓、神經根，臨床上出現脊髓損害癥狀及神經根刺激癥狀，即為后縱韌帶骨化癥(ossification of posterior longitudinal ligament，OPLL)。OPLL是一種病因尚未明確的病理現象。據統計，脊柱OPLL中70%發生于頸椎，胸椎僅占15%[1]，國內外未發現有發生于腰椎的報道。頸椎OPLL是脊髓型頸椎病的主要病因之一[1]，其預后差異很大，癥狀可以從一直處于無癥狀的穩定狀態到短時間內出現四肢癱瘓[2]。大量臨床研究已經證實，OPLL為一種遺傳因素和外界因素共同作用所致的復雜疾病。外界因素包括慢性退行性變，內分泌和代謝性疾病，糖尿病、飲食、高氟及高銅等均與OPLL有關[3]。我院脊柱外科2014年1月至2019年12月共收治頸椎OPLL患者620例，其中蒙古族患者為241例，占總數為31.2%，高于本地區蒙古族人口比例。雖然在流行病學上蒙古族OPLL還無相關調查，但由臨床上看本地區蒙古族OPLL發病率較高，發病程度較重，因此，蒙古族OPLL基因多態性研究較有意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月至2019年12月就診于內蒙古自治區人民醫院脊柱外科門診或住院部的蒙古族OPLL患者，以及同期健康體檢的蒙族人群為研究對象。納入標準：OPLL患者及健康組均符合祖籍三代及三代以上居住在內蒙古地區無血緣關系、無異族通婚史疾病病史，無氟骨癥病史、無高血壓、糖尿病等慢性基礎疾病，無腫瘤、自身免疫性疾病及其他家族性遺傳疾病的病史。排除標準：有血緣關系、有異族通婚史疾病病史，有氟骨癥病史、有高血壓、糖尿病等慢性基礎疾病，有腫瘤、自身免疫性疾病及其他家族性遺傳疾病的病史。

根據納入及排除標準，共有110例內蒙古地區蒙古族后縱韌帶骨化患者，其中男75例，女35例；年齡38～78歲，平均(53.0±12.8)歲。118例健康蒙古族人群，其中男65例，女53例；年齡45～68歲，平均(58.0±11.2)歲。研究對象年齡、性別構成比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本實驗經醫院倫理委員會同意，并且入選檢測者均簽署知情同意書。

1.2 方法 采用基因測序法對110例內蒙古地區蒙古族后縱韌帶骨化患者和118例健康蒙古族人群進行白細胞介素15受體α亞單位(interleukin-15 receptor α subunits，IL-15Rα)基因及Runt相關轉錄因子2(recombinant Runt related transcription factor 2，RUNX2)基因多態性的檢測。

1.2.1 基因組DNA提取 所有入選對象采外周靜脈血3 mL，乙二胺四乙酸(ethylenediammine tetracetic acid，EDTA)抗凝，采用天根生化科技有限公司提供的全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA，-80℃保存備用。

1.2.2 引物設計 根據GenBank提供的基因序列，將單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點作為靶序列，根據SNP位點兩側的保守序列設計引物，引物設計在NCBI網站上進行，設置的主要參數為：引物長度一般為18～24 bp；理論退火溫度Tm值55～65℃；(G+C)含量40%～70%；擴增片段大小<800 bp。由天根生化科技公司合成引物序列，聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)引物信息見表1。采用SNaPshot分型方法進行分型，對分型結果進行雙盲樣本質控和陰性對照質控。

1.2.3 聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增目片段 引物設計合成并確認DNA模板質量合格的情況下，進行PCR擴增，PCR反應體系總體系為25 μL，包括：基因組DNA 1 μL，酶0.5 μL，10×buffer 2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，三磷酸堿基脫氧核苷酸(deoxyribonucleoside triphosphate,dNTPs)0.5 μL，dd H2O 19.5 μL；PCR反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，50～65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環，72℃終末延伸10 min。PCR產物經3%瓊脂糖電泳檢測，于紫外燈下觀察是否有條帶及條帶亮度。

1.2.4 DNA序列測定 測序PCR反應所選用的試劑為ABI公司的BDT3.1測序試劑盒(Big Dye Terminator v3.1)，測序反應均按照BDT3.1使用手冊進行。測序PCR產物的純化采用BDT3.1使用手冊中的乙醇沉淀方法，干燥后4℃避光保存。甲酰胺變性需加入10 μL甲酰胺，將純化后的干粉充分溶解，隨后置于PCR儀中進行變性反應。最后上樣測序，將變性后的樣品采用3730XL進行測序。

表1 PCR-RFLP引物信息

2 結 果

健康蒙古族118例與蒙古族OPLL 110例采用χ2檢驗對rs1321075位點基因型、等位基因頻率進行比較，AC、CC型差異有統計學意義(P<0.05)，OR值(95%CI)分別為0.584(0.343，0.997)、1.978(1.166，3.353)，等位基因C的OR值(95%CI)為0.588(0.386，0.895)；對rs16873379位點基因型、等位基因頻率進行比較，CT、TT型差異有統計學意義(P<0.05)，OR值(95%CI)分別為2.756(1.595，4.760)、0.266(0.153，0.461)，等位基因C的OR值(95%CI)為2.514(1.678，3.768)；對rs2296139位點基因型、等位基因頻率進行比較，AA基因型差異有統計學意義(P<0.05)，OR值(95%CI)為0.416(0.218，0.797)；其他位點基因型、等位基因頻率進行比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

表2 兩組RUNX2基因及IL-15Rα基因型和等位基因頻率分布比較

3 討 論

OPLL是一種高發于東亞地區的常見病。日本的發病率為1.9%～4.3%，韓國約為3.6%，中國臺灣約為2.8%，而北美白人僅為0.12%[4-5]。根據李中實等[6]的調查，中國北方人群的OPLL發病率為0.44%～8.92%。1981年日本頸椎OPLL患者直系親屬與其他親屬的OPLL發病率分別為23%和22%，而普通人群僅為3.7%[7]，這表明頸椎OPLL有基因遺傳基礎。因調查人群中兄弟姐妹間種族隔離率為0.26，大于隱性特性的理論最大值0.25，故推測其為顯性遺傳。Terayama[8]調查了347例OPLL患者家庭，共1 030例家庭成員，發現影像學表現為OPLL的患者父母達26.5%，兄妹中發現OPLL的占28.89%，符合常染色體顯性遺傳特點。2003年，Tanaka等[9]采用全基因組掃描手段，研究了142例日本OPLL患者，發現1p、6p、11q、14q、16q和21q可能為OPLL的易感基因區域，而位于21q22·3的微衛星標志D21S1903具有強烈的關聯性。目前懷疑的易感基因包括膠原11A2(COL11A2)、膠原6A1(COL6A1)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1，ENPP1)重組蛋白、骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、瘦素受體、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)、視黃酸X受體β(retinoid X receptorretinoid β，RXRβ)、雌激素受體、白細胞介素(interleukin，IL)-1、RUNX2、血管生成素-1(angiopoietin-1，ANG-1)以及G蛋白偶聯嘌呤受體P2Y1(G protein coupled purinergic receptor，P2RY1)等[10]。2016年陳欣等[11]報道，利用目標基因測序技術，對11個已知OPLL致病基因進行了檢測，發現COL11A2是OPLL易感基因。

Runt相關轉錄因子(recombinant Runt related transcription factor 2，RUNX)家族的轉錄因子協調了細胞的各種發育過程，如細胞增殖、分化和細胞譜系專項分化。RUNX基因是根據發育調控基因Runt的發現命名的，Runt被認為是早期胚胎分割的關鍵。RUNX轉錄因子包括RUNX1、RUNX2和RUNX3。RUNX2是骨骼發育的主要調節因子，在成骨細胞和軟骨細胞譜系的規范和分化中發揮多種作用[12]。軟組織中的新生骨形成是通過間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化為成骨細胞來實現的，成骨細胞成熟為骨細胞并最終形成骨，這一過程稱為膜內骨化，RUNX2基因是MSCs向成骨細胞分化的特異性轉錄調節因子。成骨細胞的命運選擇和導致膜內骨化的成熟途徑在很大程度上由RUNX2控制。軟骨分化則由RUNX2和RUNX3共同調節[12]。Kishiya等[13]應用DNA微陣列檢測RUNX2基因表達，發現韌帶骨化癥患者RUNX2基因表達增強。他們將骨化的后縱韌帶細胞進行體外培養，然后應用RNA干擾(RNA interference，RNAi)抑制RUNX2基因的表達，發現骨化細胞促血管生成素-1表達明顯下調，而正常細胞的表達沒有明顯差異，提示促血管生成素-1在脊柱韌帶異位骨化過程中也起重要作用。Liu等[14]以COL6A1、RUNX2、BMP-2、維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)4組基因，對82例OPLL患者及118例健康對照進行了研究，得出RUNX2的RS1321075及RS12333172兩個位點與OPLL強烈相關。

IL-15是繼IL-2之后被發現的又一重要的T細胞生長因子，它的生物學活性廣泛，經證明在某些臨床疾病中有其獨特的作用，IL-15Rα是白細胞介素15受體異源三聚體(interleukin-15 receptorαβγsubunit，IL-15Rαβγ)的重要組成部分。除了參與高特異、高親和力受體的組成外，IL-15Rα還具有一個非常罕見的特性，即無需β和γ亞單位的參與，其獨自便能夠以極高的親和力同IL-15結合。IL-15Rα在免疫發展和功能作用上起重要作用，它與IL-15的高度親和性使它在IL-15的信號傳導上起重要作用。IL-15Rα是促炎信號轉導的重要組成部分，由于其參與多種生理和代謝過程而日益受到人們的重視。IL-15和IL-15Rα水平在運動引起的低度炎癥中急劇升高[15]，在類風濕性關節炎等病理條件下也有慢性升高，尤其是在關節滑液中可以升高[16]。Petrovic-Rackov等[17]報道，在骨關節炎和類風濕性關節炎的患者血清和滑液中IL-15水平明顯高于骨關節炎的患者，且與疾病活動相關。IL-15Rα基因的SNP與骨量有關[17]。Loro等[18]研究IL-15Rα在成骨細胞調節和骨礦化中的作用，證明IL-15Rα是保證成骨細胞/破骨細胞有效結合所必需的，在決定成骨細胞磷酸穩態和礦化能力方面起重要作用，尤其對皮質骨礦化至關重要。

Kim等[19]首先報道，通過研究166例OPLL患者和230例健康人群對比，IL-15Rα的(rs2228059，Asn182Thr)多態性可能與韓國人OPLL的易感性有關。Guo等[20]報道，通過研究235例漢族OPLL患者和250例漢族健康人群，也得出IL-15Rα的(rs2228059，Asn182Thr)多態性是OPLL的易感因素。

本實驗采用基因測序法對內蒙古地區蒙古族OPLL患者110例進行RUNX2基因及IL-15Rα基因多態性的檢測，發現蒙古族OPLL患者都與rs1321075位點、rs16873379位點和rs2296139位點有關。rs1321075位點AC型、等位基因C可能為保護因素，CC型可能為危險因素；rs16873379位點CT型、等位基因C為危險因素，TT型為保護因素；rs2296139位點AA基因型為保護因素，其他位點基因型、等位基因頻率進行比較，差異無統計學意義(P>0.05)

綜上所述，RUNX2基因及IL-15Rα基因中rs1321075位點、rs16873379位點和rs2296139位點基因多態性，在內蒙古地區蒙古族OPLL人群中可能起到一定的作用。