MiR-27b-3p靶向ID-3調控骨肉瘤細胞增殖的研究

李志強，劉樹江，沈朝，郝玉升，吳文杰，苑萌萌

(河北省滄州市人民醫院骨科，河北 滄州 061000)

骨肉瘤好發于兒童和青少年，病理形態中觀察到明確的腫瘤性骨細胞形成，惡性程度較高，并具有高增殖的特征[1]。DNA結合/分化抑制蛋白-3(DNA binding/differentiation inhibitory protein-3，ID-3)是近年關注到與腫瘤形成相關的因子，其在骨肉瘤中表達上調，能抑制細胞分化，促進腫瘤細胞增殖和侵襲。有學者發現微小RNA(microRNA，miRNA)是ID-3的上游因子[2]。miRNA是近年關注到的與腫瘤形成有關的非編碼單鏈小RNA，由19～25個核苷酸組成，通過與目標基因的3′非翻譯區結合，調控病變的形成和進展[3]。我們應用生物信息分析進行篩選，發現微小RNA-27b-3p(microRNA-27b-3p，miR-27b-3p)在骨肉瘤中可能異常表達，同時應用TargetScan和Mirtarbase預測到ID-3可能是miR-27b-3p下游的靶基因(見圖1)。基于此，本實驗檢測骨肉瘤細胞系和腫瘤病變組織中miR-27b-3p的表達，分析miR-27b-3p靶向ID-3對腫瘤細胞增殖的調節作用。

圖1 miR-27b-3p與ID-3可能的堿基互補序列

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細胞系U20S購于中國科學院上海細胞生物學研究所。應用RPMI 1640培養基(美國Gibco公司，貨號SS16-1209)進行培養。兔抗人ID-3多克隆抗體(武漢博士德生物技術公司，貨號DR106629-16，稀釋倍數1∶4 000)和兔抗人增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)多克隆抗體(武漢博士德生物技術公司，貨號DR108525-10，稀釋倍數1∶4 000)，RIPA裂解液(RIPA lysis buffer，RIRP)(武漢博士德生物技術公司，貨號DR106623-12)、胰酶消化液(武漢博士德生物技術公司，貨號DR106965-01)、質粒提取試劑(武漢博士德生物技術公司，貨號DR109623-03)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(武漢博士德生物技術公司，貨號DR106690-15)、羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號DR100023-08，稀釋度1：3500)及二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)(武漢博士德生物技術公司，貨號DR100025-05)。Lipofetamine 2000(Invitrogen公司，貨號6958-7415)和雙熒光素酶試劑盒(Invitrogen公司，貨號0152-1098)。引物由上海吉瑪生物合成，細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)(北京索萊寶生物公司，貨號CH-171502A)。采用MK3型酶標儀(美國Thermo公司)及IQ5聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)儀(美國Bio Rad公司)。

1.2 臨床資料 納入標準：(1)首次發病并手術切取病變組織，經病理確診，符合世界衛生組織(world health organization，WHO)中的標準。(2)臨床及病理資料齊全。排除標準：(1)診斷不明確或合并有其他腫瘤成份；(2)術前行放、化療；(3)伴有嚴重內科疾病。根據納入與排除標準，應用前瞻性研究方法選擇2016年1月至2017年4月確診為骨肉瘤的患者40例，其中男22例，女18例；年齡4～88歲，平均(16.3±4.3)歲。留取新鮮的腫瘤組織(-80℃凍存)。患者或家屬均簽定知情同意書，研究經醫院倫理委員會批準(醫學倫理批準文號2016-0105A)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 細胞復蘇后，應用10%胎牛血清的RPMI1640培養基在37℃、5% CO2細胞培養箱中培養，每2天更換1次培養基，當細胞生長達到80%的融合度時，接種于12孔板，將細胞密度調至5×105個/孔。構建質粒進行細胞轉染，建立空白對照組(NC組)、空載體轉染組、miR-27b-3p mimic組、miR-27b-3p mimic和siRNA ID-3共轉染組，嚴格按說明書操作。空白對照組：不做轉染。空載體轉染組：轉染空質粒。miR-27b-3p mimic組：轉染含miR-27b-3p mimic質粒(miR-27b-3p mimic由上海吉瑪基因公司合成)。miR-27b-3p mimic和siRNA ID-3共轉染組：共同轉染含miR-27b-3p mimic質粒和含siRNA ID-3質粒(miR-27b-3p mimic和siRNA ID-3由上海吉瑪基因公司合成)。

1.3.2 雙熒光素酶報告基因實驗 檢測miR-27b-3p對ID-3 3'非翻譯區(3' untranslated region，3' UTR)結合情況。將含有ID-3 mRNA 3'UTR的野生型(pGL3-ID-3-WT)和突變型(pGL3-ID-3-MT)報告質粒，分別同miR-27b-3p mimic、空白對照共轉染到人骨肉瘤細胞株U2OS中，轉染3 h后換液，在5% CO2、37℃培養箱中繼續培養48h后觀察熒光素酶活性。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)實驗 應用RT-qPCR檢測miR-27b-3p的表達。Trizol提取總RNA。miR-27b-3p引物上游：5＇-TCGAAAACTGGCCAAGCCTGC-3＇，下游：5＇-TGCTTAAATCCAGGAATTGCT-3＇。U6為內參，引物上游：5＇-GGCAGAAAGATTAGC-3＇，下游：5＇-TTGGAACGCAAATTCCG-3＇。應用逆轉錄法合成cDNA。擴增程序：95℃ 15 min；95℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，共30個循環。于60℃采集信號。讀取CT值，以2-ΔΔCT法表示結果。ΔΔCT=[CT目的基因(未知樣品)-CT對照(未知樣品)]-[CT目的基因(校正樣品)-CT對照(校正樣品)]。

1.3.4 免疫組化實驗 免疫組化二步法檢測骨肉瘤石蠟包埋組織中ID-3和PCNA的表達。切取4μm切片，DAB顯色。ID-3的表達部位是細胞質和/或細胞膜，PCNA的表達部位是細胞核，隨機選擇5個400倍視野(熱點區)，計算陽性率，取平均值。

1.3.5 Western Blot實驗 應用Western Blot法檢測ID-3和PCNA的表達。基于新鮮組織，提取總蛋白，依次完成蛋白變性、加樣、電泳、電轉膜、免疫雜交步驟后取出膜加入發光液，膠片盒曝光3 min，顯影15 s。以目的蛋白與GAPDH的比值作為定量結果進行分析。

1.3.6 CCK-8法檢測細胞活性 各組細胞消化轉染后按每孔3 000個左右接種，孵育過液，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，避光孵育2 h，酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光值。細胞活力計算公式：細胞活力(%)=(Absample-Abbland)/(Abcontrol-Abbalnd)×100%。

1.3.7 集落形成實驗 消化轉染后的細胞收集到離心管中，計算細胞濃度，在6孔板中每孔加入500個細胞，每組設3個復孔，每48 h更換培養基1次，培養14 d后吸走培養基，加入無水乙醇固定20 min，再用0.5%的結晶紫染色20 min，去離子水清洗觀察。

2 結 果

2.1 雙熒光素酶報告基因實驗結果 構建含有野生型ID-3 mRNA 3'UTR的pGL3-basic質粒(pGL3-ID-3-WT)，構建含有miR-27b-3p結合位點缺失的突變型ID-3 mRNA 3'UTR的質粒(pGL3-ID-3-MT)。分別與空白對照組(NC)、miR-27b-3p mimic組進行培養，檢測熒光素酶的表達。結果發現miR-27b-3p mimic與pGL3-ID-3-WT共轉染組的細胞系中熒光素酶活性顯著降低，而與 pGL3-ID-3-MT共轉染的細胞系中無明顯變化，提示miR-27b-3p與ID-3的3'UTR具有結合的能力(見圖2)。

注：*P<0.05

2.2 各組細胞增殖能力 檢測轉染第0～5天細胞的活性。相對于空白對照組、空載體轉染組，miR-27b-3p mimic組細胞活性于第2天開始下降，持續到第5天，而共轉染組能夠逆轉miR-27b-3p mimic組的細胞活性(見圖3)。

圖3 各組細胞增殖能力

2.3 各組細胞中ID-3和PCNA的表達 相對于空白對照組、空載體轉染組，miR-27b-3p mimic組ID-3和PCNA的表達均下降，而共轉染組能逆轉上述改變(見圖4～5)。

圖4 各組細胞中ID-3和PCNA的表達

圖5 各組細胞中ID-3和PCNA的表達

2.4 各組細胞集落形成實驗 相對于空白對照組的(51.2±4.3)個、空載體轉染組的(48.8±3.9)個，miR-27b-3p mimic組(31.5±6.7)個中肉眼可見的克隆集落數量明顯減少，而共轉染組能逆轉上述改變(47.4±4.4)個(見圖6～7)。

圖6 集落形成實驗圖 圖7 集落形成實驗柱狀圖

2.5 骨肉瘤中miR-27b-3p與ID-3、PCNA的相關分析 采用RT-qPCR法檢測骨肉瘤中miR-27b-3p的表達量為1.2～4.3，平均(2.5±0.8)。免疫組化檢測ID-3的陽性率為6%～70%，平均(34.3±9.0)%；PCNA增殖指數8%～85%，平均(46.5±8.8)%。相關分析顯示miR-27b-3p與ID-3(r=-0.58，P=0.014)、miR-27b-3p與PCNA(r=-0.54，P=0.021)呈負相關性，ID-3與PCNA(r=0.52，P=0.030)呈正相關性(見圖8～9)。

圖8 骨肉瘤中miR-27b-3p溶解曲線(RT-qPCR)

a PCNA的表達 b ID-3的表達

2.6 miR-27b-3p表達與生存時間的關系 患者均進行術后3年(36個月)生存時間的隨訪，截止時間點為2020年4月30日。其中存活19例，死亡20例，失訪1例。死亡患者生存時間為6～36個月，中位生存時間為25個月。生存分析顯示miR-27b-3p的表達與生存時間相關，即miR-27b-3p低表達患者的預后差(見圖10)。

圖10 miR-27b-3p表達的生存分析

3 討 論

骨肉瘤常用的細胞株包括鼠源性細胞株S-SLM、K7M2、Kl2、UMR106-01、Dunn、LM7、LM8和人源性細胞株MG-63、POS-l、HOS-58及SAOS-2等。ID-3在人源性細胞株包括MG-63、POS-l、HOS-58及SAOS-2中均有表達。人骨肉瘤細胞株U2OS是由Ponten和Saksela在1964年從一名15歲女孩的脛骨中等分化的肉瘤中分離建立。從體外培養看，人骨肉瘤細胞株U2OS增殖速度快于其他細胞株，且細胞呈多形性。U2OS構建的裸鼠移植瘤模型生長速度塊，有很明顯的生長趨勢，惡性程度中等，裸鼠存活期大約68 d，允許研究人員有足夠的時間對其進行干預和研究，且移植瘤瘤體較大，便于操作和觀察。骨肉瘤的形成涉及DNA、RNA及蛋白的異常表達[4-5]。近年關注到miRNAs的表達失調是腫瘤形成的重要促進因子，其作用途徑主要是通過調控靶基因實現[6]，主要涉及細胞增殖、凋亡、遷移及分化的各種生物學過程。microRNA在人類各種腫瘤中扮演著重要的角色，作為致癌基因和抑癌基因，主要作用機制包括調控基因擴增、缺失、突變和轉錄因子的異常表達等。miR-27b-3p可以促進骨肉瘤細胞的增殖，但臨床中尚未明確其調控骨肉瘤細胞的途徑和通路[7]。miR-27b-3p是我們關注的重要因子，其異常表達是腫瘤形成的關鍵事件。ID-3是篩選出的與miR-27b-3p具有互補配對序列的因子，二者均參與細胞增殖和細胞周期的調控中。分化差的腫瘤常伴有ID-3的高表達，這類細胞具有“永生化”的特征[8]。ID-3具有阻止細胞分化的作用，細胞趨于原始，腫瘤呈高度的侵襲性及增殖活性[9]。也有學者認為ID-3是誘導癌基因形成的因子之一，主要調節細胞增殖、血管生成及抑制凋亡[10]。本實驗中應用PCNA作為標記增殖指標的因子，效果理想，能客觀反映其所標記細胞的增殖特征。

實驗顯示骨肉瘤細胞系中miR-27b-3p能引起轉染pGL3-ID-3-WT的細胞中熒光素酶活性降低，提示miR-27b-3p能與ID-3的3'UTR區結合，證實了在TargetScan和Mirtarbase預測到的miR-27b-3p與ID-3具有互補序列的結果，也提示二者具有靶向關系。結果顯示miR-27b-3p mimic組細胞活性明顯下降、克隆集落數量明顯減少、PCNA的表達下調，而miR-27b-3p mimic和siRNA ID-3共轉染組能逆轉上述表達水平，提示miR-27b-3p和ID-3結合后對調控細胞增殖有重要作用，即miR-27b-3p通過負調控ID-3抑制骨肉瘤細胞的增殖。骨肉瘤組織中發現miR-27b-3p與ID-3、miR-27b-3p與PCNA、ID-3與PCNA具有相關性，間接證實了上述結論。ID-3對細胞增殖調控通路是骨肉瘤形成過程中細胞失控性增生時的重要通路，ID-3高表達時細胞停滯于S期，細胞活性增強。MiR-27b-3p低表達時促進ID-3對細胞增殖的作用。有資料顯示miR-27b-3p在正常的間葉源性組織中有一定的表達，而在間葉源性惡性腫瘤和自身免疫性疾病中常伴有miR-27b-3p表達的下調，對腫瘤微環境的形成有一定的影響[11-12]。MiR-27b-3p可能作為腫瘤抑制基因發揮作用[13]，其下游基因較多，本實驗觀察到的ID-3即為重要的下游基因[14]。但我們也觀察到miR-27b-3p在腫瘤中的作用是復雜的，如對FZD7的調控發揮抑制腫瘤進展的作用[15]，通過對Bmal1的調節抑制肝細胞的異型增生等[16]。研究顯示[17]，加入miR-27b抑制劑可以抑制骨肉瘤細胞SAOS-2細胞的增殖。miR-27b-3p可通過調控靶基因CDH11而影響宮頸癌細胞的生物學行為，促進宮頸癌細胞的增殖和侵襲能力，促使宮頸癌細胞發生上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，從而促進宮頸癌的發生發展[18-20]。因此，miR-27b-3p在腫瘤中是個多功能的因子[21-22]，從細胞學實驗證明，miRNA-27b-3p可以促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，對miR-27b-3p下游多項靶基因調控的研究有重要意義。結果觀察到miR-27b-3p的表達與生存時間相關，提示miR-27b-3p的表達與預后有關，miR-27b-3p可能是判斷骨肉瘤預后的獨立危險因子。但是關于miR-27b-3p在腫瘤預后判斷中的具體價值需要后續研究進行多中心、大樣本、多因素分析后進一步明確。

綜上所述，miR-27b-3p低表達是骨肉瘤形成的重要分子事件，表明miR-27b-3p可能為一個潛在的靶點用于骨肉瘤治療。MiR-27b-3p靶向負調控ID-3抑制骨肉瘤細胞的增殖，MiR-27b-3p的表達與腫瘤的預后相關。