基于16S rDNA 測序的皮脂溢出患者腸道菌群分析

葉巧園，丁元林，朱 堅，江浩波，王 琳* （.廣東醫科大學，廣東東莞 53808；.東莞東華醫院，廣東東莞 530）

皮脂溢出是指在前額、鼻部、頭皮、背部這些皮脂腺分布密集的部位油膩，其確切病因和發病機制尚未完全明了，有研究認為遺傳因素及雄激素水平增高是導致皮脂腺分泌增加的核心因素[1-3]。皮脂腺細胞具有促腎上腺皮質激素釋放激素、雄激素以及多種神經肽的多種受體[4-5]，精神刺激、某些疾病如抑郁癥、腎上腺腫瘤會使機體的皮脂分泌明顯增加，糖尿病、動脈硬化、肥胖、乳腺癌、高脂飲食也可令皮脂分泌增加。腸道菌群失調可引起雄激素水平變化、脂質代謝紊亂，與肥胖、代謝綜合征、生殖、婦科腫瘤等疾病有極為重要的關系[6-9]。為了解腸道菌群失調與皮脂溢出的聯系，本研究基于16S rDNA 測序的技術手段，對皮脂溢出患者及健康對照人群腸道菌群進行了初步分析。

1 資料和方法

1.1 研究對象

納入2019 年10 月-2020 年4 月東莞東華醫院皮膚科收治的皮脂溢出患者10 例（研究組），均符合以下納入標準：面部皮膚和頭發多脂、油膩鱗屑增多，同時伴有脂溢性皮炎、痤瘡及毛囊炎；愿意配合研究收取合格的糞便標本；在東莞市定居超過2 a。同期隨機抽取健康對照者10 例（對照組），均符合以下標準：無皮脂溢出癥狀，在東莞定居超過2 a。兩組均已排除以下人員：6 個月內服用過糖皮質激素、抗生素、益生菌、免疫抑制劑、維甲酸類藥物、中藥者；哺乳期者；吸煙酗酒者；惡性腫瘤或嚴重內科疾病者；腸道疾病患者；有胃及下消化道手術史者。研究組中，男6例，女4 例；年齡31～57 歲，平均（44.7±5.2）歲。對照組中，男6例，女4例；年齡34～58歲，平均（45.9±5.9）歲。兩組患者的性別、年齡差異無統計學意義（P＞0.05)。

1.2 主要儀器及試劑

CR 儀（美國Biorad 公司）、QuantiFluor TM-ST 定量儀（美國Promega）、Qubit 3.0（美國Life Invitrogen）、凝膠成像系統（美國Biorad 公司）、冷凍高速離心機（德國Sigma）、核酸電泳儀（美國Biorad公司）、Illumina Hiseq 測序平臺（美國SeqHealth）。AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒（美國Axygen Biosciences）、溴化乙錠（上海生工）、50×TAE電泳緩沖液（上海生工）、FastPfu高保真酶（美國NEB）、Illumina基因組DNA文庫制備試劑盒（美國Illumina）。

1.3 糞便標本采集及DNA 提取

受試人員在醫院用糞便收集器采集新鮮糞便樣本2～3 g，迅速放入-80 ℃環境中保存。采用CTAB或SDS 方法對樣本的基因組DNA 進行提取，并對DNA的純度和濃度進行檢測。

1.4 16S rDNA 基因擴增及高通量測序

根據測序區域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物和高保真DNA 聚合酶對選定的V3-V4(上下游引物序列分別為5′-X-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′可變區進行PCR 擴增。PCR 產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標片段進行切膠回收，膠回收采用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）。參照電泳初步定量結果，對PCR 擴增回收產物用QuantiFluor?-ST 藍色熒光定量系統（Promega 公司）進行檢測定量，按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。使用NEB Next?Ultra?DNA Library Prep Kit 建庫試劑盒進行文庫構建。構建好的文庫通過Agilent Bioanalyzer 2100 和Qubit 進行質檢，文庫質檢合格后進行上機測序。

1.5 數據分析

對原始測序數據通過barcode 分配reads，獲取有效序列。運用Mothur 軟件對序列進行質量控制、過濾、去除嵌合體，得到優化序列。通過USEARCH 軟件對序列進行分類單元（Operational Taxonomic Units）聚類，將序列相似度≥97%的序列歸為同一OTU，然后通過OTU 與數據庫比對，對OTU 進行物種注釋。通過Alpha Diversity(α 多樣性分析)，Beta Di-versity(β 多樣性分析)，等數據分析手段，最終得到糞便菌群的物種豐度信息。采用獨立樣本t檢驗(雙側)方法，對樣本有效序列的群落豐富度指數和群落多樣性指數進行比較分析。

2 結果

2.1 樣本測序數據分析

從研究人群中共獲得20 個糞便樣本進行測序，其中研究組和對照組各10 個樣本。高通量焦磷酸測序共產生1 326 101條有效序列，其中，10個研究組樣本共獲得652 492 條有效序列(平均每個樣品序列數為65 249±381)。對照組10 個樣本獲得673 609 條有效序列(平均每個樣品序列數為67 361±359)。

將測序得到的下機數據（Raw PE）進行拼接、質控及去嵌合體。得到Q20，Q30均在90%以上，表明質控數據良好，能夠滿足實驗分析要求。通過Rarefaction Curve 及Shannon 曲線（圖1～3)，可以看出，樣品測序數據量合理，可以反映樣本中絕大多數的微生物信息。圖3 顯示研究組與對照組擁有856 個相同OTUs，研究組、對照組特有的OTUs 分別有35、60 個。

圖1 RarefactionCurve曲線

圖2 Shanno曲線

圖3 研究組和對照組之間的OTUs組成

2.2 腸道微生物α多樣性分析

α 多樣性指標用于表征樣品內的微生物群落多樣 性。α 多樣性指數包括Observed species、ace、Chao、Shannon 和Simpson 等5 個指數。反映群落豐富度的Observed species、ace 和Chao 指數，以及反映群落多樣性的Shannon 和Simpson 指數，研究組均低于對照組(P＜0.05)。表1 及圖4～7 顯示研究組比對照組的腸道菌群群落豐富度和多樣性均發生了一定變化。

表1 研究組和對照組α多樣性參數的比較

圖4 Observed_Species 指數

圖5 Shannon指數組間差異箱形圖

圖6 Chao1指數

圖7 PD_whole_tree指數

2.3 腸道微生物β多樣性分析

采用weighted UniFrac 指數衡量β 多樣性。β 多樣性分析(β diversity)是用來比較物種多樣性方面存在的差異大小。如果樣品距離越接近，表示物種組成結構越相似，因此群落結構相似度高的樣品傾向于聚集在一起，群落差異很大的樣品則會遠遠分開。主坐標分析PCoA 圖顯示，除個別樣本存在偏差，研究組和對照組基本呈現在不同區域（圖8）。

圖8 基于Weighted Unifrac距離的PCoA分析

2.4 研究組與對照組間的細菌種群差異

采用LefSe 分析法，進一步探討各組間的分類區別。我們在研究組和對照組發現了48 個差異顯著的種群，所有這些分類群的LDA 均大于2。與研究組樣本相比，健康組中的細菌類群較豐富，有26 條富集于健康組，20條富集于研究組（圖9）。

圖9 LefSe分析圖

2.5 門水平腸道菌群序列分類分析

在門水平上，厚壁菌門（Firmicutes）及擬桿菌門（Bacteroidetes）為絕對優勢菌群，約占總序列數85%。研究組、對照組中腸道菌群物種豐度較高的厚壁菌門（Firmicutes，74.51%vs70.13%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，10.43%vs15.61%）、變形菌門（Proteobacteria，11.64%vs7.25% ）、放線菌門（Actinobacteria，3.31%vs3.11%）差異均無統計學意義（P＞0.05）。研究組中梭桿菌門（Fusobacteria）比對照組降低了84.5%（0.43%vs2.78%，P＜0.05）（圖10）。

2.6 科水平腸道菌群序列分類分析

在科水平上，螺旋藻科、瘤胃球菌科是相對優勢菌群，約占總序列數60%。與對照組相比，腸道菌群物種豐度較高的螺旋藻科（Lachnospiraceae，32.02%vs 32.11%）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae，28.61%vs26.26%）差異均無統計學意義(P＞0.05)。研究組擬桿菌科（Bacteroidaceae）降低了33.12%（7.46%vs11.12%）而腸桿菌科（Enterobacteriaceae）升高了36.65%（10.15%vs6.43%）（圖11）。

圖11 科水平物種差異

2.7 屬水平腸道菌群序列分類分析

在屬水平上，研究組糞桿菌屬（Faecalibacterium）升高了45.07%（18.25%vs12.58%），擬桿菌屬（Bacteroides）降低了32.91%（7.46%vs11.12%），而勞特氏菌屬（Blautia，10.09%vs9.95%）、羅斯氏菌屬（Roseburia，6.19%vs7.43%）差異均無統計學意義(P＞0.05)（圖12）。

圖12 屬水平物種差異

2.8 種水平腸道菌群序列分類分析

在種水平上，研究組普拉氏梭桿菌（Faecalibacterium prausnitzii）、活潑瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）、大腸桿菌（Escherichia coli）分別升高了45.07%（18.25%vs12.58%）、39.01%（3.35%vs2.41%）、155.12%（3.98%vs1.56%），而布氏瘤胃球菌（Ruminococcus bromii）下降了372.54%（0.51%vs2.41%）（圖13）。

圖13 種水平物種差異

2.9 PICUSt腸道菌群功能預測分析

采用PICUSt 軟件對16S 測序樣本中可能存在的各級KEGG 通路及豐度值進行預測。研究組有5 條通路與對照組差異有統計學意義（P＜0.05）（圖14），分別為ATP 結合盒轉運蛋白(ABC transporters)、嘌呤代謝(Purine metabolism)、精氨酸和脯氨酸代謝(Arginine and proline metabolism)、精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）和癌癥中樞碳代謝(Central carbon metabolism in cancer)。

圖14 差異通路圖

3 討論

人體是由自身器官和微生物組成的超級生物體，微生物與宿主共同進化，并且與宿主之間不斷地進行物質交換和信息交流，其中約有80%的微生物存在于腸道，參與了腸道營養物質的吸收、分布、代謝和排泄，微生物與宿主之間互相依存互相制約，處于一個動態平衡的狀態。當腸道菌群發生改變，可引起腸道吸收屏障的變化，引起腸道免疫系統的應答異常，從而參與多種疾病的發生及轉歸。腸道菌群根據對人體是否有益分為益生菌、有害菌。根據菌群代謝途徑的特點，擬桿菌和瘤胃球菌屬可主導蛋白質和動物脂肪的吸收，普氏菌屬可提高糖類飲食的吸收[10]。根據疾病的發病結果來看，高豐度的擬桿菌門和硬壁菌可引起能量過度吸收，引起肥胖。高豐度擬桿菌、瘤胃球菌促進腸道炎癥反應，而普拉梭菌、柔嫩梭菌可產生短鏈脂肪酸減少腸道炎癥反應[11]。腸道益生菌減少，大腸桿菌增多，腸道革蘭陰性菌增多、腸道菌群豐度降低與胰島素抵抗有關[12]。

本文中，研究組的腸道菌群群落豐度和多樣性均低于對照組，在門、科、屬水平擬桿菌下降，表示腸道的蛋白質、脂肪以及能量吸收較對照組低。研究組的厚壁門/梭桿菌比值發生變化，說明皮脂溢出患者腸道處于病理炎癥狀態。但另外一方面普拉氏梭桿菌科升高，可產生較多短鏈脂肪酸，其中丁酸對腸道的有保護作用。閆慧敏等[13]對10 位重度痤瘡的青年患者（平均年齡24.4 歲）進行16S 測序結果顯示厚壁門/擬桿菌比值正常，但產生丁酸鹽的細菌減少，與本研究結果恰好相反，這可能和選取的年齡階段不一致有關，提示不同年齡階段的皮脂溢出患者的發病原因不同。此外腸道內擬桿菌、瘤胃球菌增高的患者體內往往伴有更多的體內脂肪含量、高胰島素血癥以及血清甘油三酯和游離脂肪酸增高，肥胖、糖尿病和心血管疾病的風險增加，革蘭陰性菌增加可引起胰島素抵抗[14]。但本文結果相反，擬桿菌科下降，革蘭陰性菌明顯下降，提示不同基礎病的皮脂溢出患者代謝通路存在差異。

革蘭陰性菌豐度增加可產生大量的脂多糖，會引起腸黏膜通透性改變，產生內毒素，引起肝細胞損傷，同時脂多糖激活TLRs通路促進肝星狀細胞(HSC)活化，從而導致炎癥和纖維化，誘發肝硬化[15]。本文研究組的革蘭陰性菌（梭桿菌門、擬桿菌屬）顯著下降，說明中年皮脂溢出患者的腸道中有絕對優勢的革蘭陽性菌群對肝臟有保護作用。但同時我們發現，研究組條件致病菌腸桿菌明顯增加，腸桿菌科主要參與糖代謝，通過兩條代謝途徑，一方面產生有機酸，如琥珀酸、乙酸、乳酸、甲酸；另一方面代謝產生內生性的乙醇和丁二醇，對肝細胞有損傷作用。我們知道補充益生菌可抑制腸桿菌的滋生，所以我們推測中年皮脂溢出的患者，長期口服益生菌可抑制體內腸桿菌，保留了革蘭陽性菌的優勢，通過影響腸道菌群分布，可能會起到保肝作用。

厚壁門/擬桿菌的比值改變，腸桿菌增多，可引起腸道的炎癥反應，消化道功能紊亂可影響鋅、銅等微量元素吸收，當體內鋅含量下降時,表皮脂類代謝障礙、表皮角化過度,皮脂分泌增多,同時嗜脂性糠秕馬拉色菌繁殖增加；角質層屏障功能下降又會加重原有的皮脂溢出[16]。

我們采用PICUSt 軟件對16S 測序樣本中可能存在的各級KEGG 通路及豐度值進行預測。研究組有5 條通路與對照組存在差異，其中精氨酸和脯氨酸代謝通路也是抑郁癥患者的腸道菌群高頻代謝通路，說明不良情緒在中年皮脂溢出得發病中起著重要作用。腸道菌群通過多種途徑與體內支配胃腸道的中樞神經系統發生相互作用，細菌通過直接或間接作用，參與合成激素和神經遞質“腦-腸”作用，具體參與的腸道細菌種類以及代謝機理，需要進一步進行更為深入的代謝產物檢測，采用大數據關聯分析，以得出更為準確、詳盡的研究結果。