大鼠急性胰腺炎外分泌細胞自噬中miR-148a的作用研究

陳希妍 張建新 孔令宇 牛麗丹 李廣鵬 朱秀英 石金河

新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院急診科(衛(wèi)輝 453100)

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是臨床常見的胰腺無菌性炎癥，由于其發(fā)病機制并不明確，對其有效的治療方式也較為缺乏，可導致全身炎癥反應(yīng)綜合征或多器官衰竭[1- 2]。微小RNA(microRNA, miRNA)是長度約為20- 22核苷酸的非編碼RNA，其具有調(diào)控靶基因表達的作用，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。研究顯示上調(diào)miR- 383的表達可抑制AP病程中胰腺腺泡細胞的自噬功能[3]。miR-148a可通過Hedgehog信號通路調(diào)節(jié)肝星狀細胞的自噬[4]，并且死亡患者血清miR-148a相對表達量低于生存患者，提示miR-148a可能與急性胰腺炎患者的預后存在聯(lián)系[5]。而miR-148a是否可通過調(diào)節(jié)AP過程中腺泡細胞的自噬而調(diào)節(jié)炎性因子的釋放及腺泡細胞的活性還鮮見報道。本研究以AR42J細胞為研究對象, 利用AP模型，檢測miR-148a對AP過程中細胞自噬的影響，為臨床AP的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞

大鼠AR42J細胞購自于美國ATCC細胞庫，本研究獲本院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑

胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液購自于美國Gibco公司。牛磺膽酸鈉鹽(TLCs)購自于美國Sigma公司。miR-148a mimics、陰性對照miR-148a、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自于蘇州吉瑪基因公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司。Beclin1抗體購自于美國SANTA Cruz公司，LC3抗體購自于美國CST公司，GAPDH抗體購自于美國Sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠胰腺AR42J細胞的培養(yǎng) AR42J細胞培養(yǎng)于的RPMI1640培養(yǎng)液中(含20%胎牛血清，含100 U/mL 青霉素及0.1 mg /mL鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2的無菌恒溫培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代1次，選取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染及細胞分組 按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的使用說明，利用Lipofectamine 2000將 miR-148a mimics與陰性對照miR-148a轉(zhuǎn)染至AR42J細胞中。細胞分為正常對照組(正常培養(yǎng)48 h，normal control group)、模型組(正常培養(yǎng)48 h后TLCs刺激20 min, model group)、陰性對照miR-148a組(轉(zhuǎn)染陰性對照miR-148a 48 h后，TLCs刺激20 min，miR-148a negative control group)，miR-148a mimics組(轉(zhuǎn)染miR-148a mimics 48 h后，TLCs刺激20 min，miR-148a mimics group)。

1.3.3 利用RT-qPCR檢測各組細胞中miR-148a mRNA的表達 取對數(shù)生長期的AR42J細胞接種于6孔板中，按照上述方法分為4組，在TLCs刺激20 min后分別提取各組細胞的總RNA，檢測RNA濃度與純度后，利用RT-qPCR檢測各組細胞中miR-148a mRNA的表達變化，(miR-148a Forward: 5′-ATGCTCAGTGCACTACAGAA- 3′; miR-148a Reverse: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT- 3′)，所有步驟均按照試劑盒及儀器的操作說明進行。

1.3.4 利用CCK- 8實驗檢測各組細胞活性 取對數(shù)生長期的AR42J細胞接種于96孔板中，接種密度為5×103個/孔，將細胞分為上述4組，在TLCs刺激20 min后檢測各組細胞活性，每孔加入10 μL CCK- 8溶液，正常培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育2 h，酶標儀450 nm處測OD值。

1.3.5 利用ELISA檢測各組細胞培養(yǎng)液中炎性因子IL- 6，IL-1β，TNF-α的水平 取對數(shù)生長期的AR42J細胞接種于6孔板中，按照上述方法分為4組，在TLCs刺激20 min后分別收集各組細胞的培養(yǎng)液，按照試劑盒說明書檢測各組細胞培養(yǎng)液中IL- 6，IL-1β及TNF-α的含量，使用酶標儀檢測吸光度值(450 nm)，計算各組細胞培養(yǎng)液中細胞因子的含量(pg/mL)。

1.3.6 利用Western blot檢測細胞中Beclin1，LC3蛋白的表達變化 取對數(shù)生長期的AR42J細胞接種于6孔板中，按照上述方法分為4組，在TLCs刺激20 min后分別提取各組細胞總蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉膜1 h，4 ℃孵育一抗過夜，抗體濃度分別是Beclin1抗體(1:500)，LC3抗體(1:1 000)及GAPDH抗體(1:10 000)，熒光II抗(1:1 000)孵育，曝光，利用Image J軟件分析灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組細胞中miR-148a mRNA的表達

為了檢測miR-148a在AP腺泡細胞中的作用，我們轉(zhuǎn)染miR-148a mimics及陰性對照 miR-148a至AR42J細胞后，用TLCs刺激20 min，然后檢測各組細胞中miR-148a的表達變化，結(jié)果見圖1，與正常對照組相比較，模型組細胞中miR-148a mRNA的表達下降(P=0.000 6)，與陰性對照 miR-148a組相比較，二者無差異；與模型組及正常對照組相比較，miR-148a mimics組細胞中miR-148a mRNA的表達均升高(P=0.000 4，P=0.000 8)，細胞中miR-148a的表達升高，說明miR-148a mimics成功轉(zhuǎn)染至AR42J細胞中。

圖1 各組細胞中miR-148a mRNA的表達(***P<0.001)

2.2 各組細胞活性

結(jié)果見圖2，與正常對照組相比較，模型組細胞的活性降低(P=0.000 8)，而與陰性對照miR-148a組相比較，兩組細胞活性無明顯差異；與模型組相比較，miR-148a mimics組細胞活性升高(P=0.005)，而與正常對照組比較，其細胞活性仍低于正常對照組中細胞的活性(P=0.009)。

圖2 利用CCK- 8實驗檢測各組細胞活性(**P<0.001，***P<0.001)

2.3 各組細胞培養(yǎng)液中炎性因子IL- 6、IL-1β、TNF-α的含量

與正常對照組相比較，模型組細胞培養(yǎng)液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL- 6的含量升高(P=0.004,P=0.003,P=0.006)，而與陰性對照miR-148a組相比較，兩組細胞培養(yǎng)液中炎性因子的含量無差異；與模型組相比較，miR-148a mimics組細胞培養(yǎng)液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL- 6的含量降低(P=0.005,P=0.000 7,P=0.001)，而與正常對照組比較，它們的含量仍高于正常對照組中細胞培養(yǎng)液中的含量。見表1。

表1 各組細胞培養(yǎng)液中炎性因子IL- 6，IL-1β，TNF-α的含量

2.4 各組細胞中Beclin1，LC3蛋白的表達變化

Western blot結(jié)果見圖3，與正常對照組相比較，模型組細胞中Beclin1的表達升高(P=0.000 9)，且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率也升高(P=0.000 6)，而與與陰性對照miR-148a組相比較，二組細胞中Beclin1的表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率無差異；與模型組相比較，miR-148a mimics組細胞中Beclin1的表達降低(P=0.004)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率也降低(P=0.000 7)，而與正常對照組比較，miR-148a mimics組細胞中Beclin1的表達升高(P=0.000 4)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率也升高(P=0.000 3)。

3 討 論

AP是一種發(fā)展迅速的炎癥性疾病，因其發(fā)病機制尚不明確，缺乏特異性靶點，臨床常用于AP治療方法的療效并不理想，使其在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率都處于較高水平[1,6]。最近，AP中基因表達的改變和信號通路的影響越來越受到研究者的關(guān)注。

microRNA的發(fā)現(xiàn)和研究，為AP診斷和治療提供了新的思路。miR-148a為微小RNA的一種，近年來越來越多的研究顯示miR-148a在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著的重要作用。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，miR-148a可通過抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲，誘導腫瘤細胞的凋亡，成為腫瘤治療的新的靶點[7- 9]。miR-148a可通過抑制蛋白激酶B(AKT)信號通路，從而抑制小鼠胰腺祖細胞的分化、增殖過程[10]。死亡患者血清miR-148a 相對表達量低于生存患者，提示miR-148a可能與急性胰腺炎患者的預后存在聯(lián)系[5]。并且，在肝臟星狀細胞的凋亡與自噬中，miR-148a發(fā)揮著重要作用，那么miR-148a在急性腺泡細胞損傷中發(fā)揮著什么樣的作用還少見報道。

本研究中，我們利用AR42J細胞的AP模型，轉(zhuǎn)染miR-148a mimics至細胞中，結(jié)果顯示，AP模型組細胞中miR-148a mRNA的表達顯著低于正常對照組與miR-148a mimics組，這也與Miao B等人的動物實驗結(jié)果相一致[11]；同時AP模型組細胞活性也顯著低于正常對照組與miR-148a mimics組。Li G等人的研究表明，miR-148a通過調(diào)節(jié)p38/絲裂原活化蛋白激酶途徑抑制椎間盤退變中促炎細胞因子[12]，Jiang K等人的研究也顯示，過表達miR-148a可顯著降低促炎細胞因子的產(chǎn)生，如IL-1β和TNF-α等[13]。我們的研究結(jié)果也顯示，與AP模型組細胞相比較，miR-148a mimics組細胞培養(yǎng)液中促炎因子IL- 6，IL-1β，TNF-α的含量顯著降低，這也與他們的研究結(jié)果相一致。這就提示，AP時細胞中miR-148a的表達降低，細胞的活性降低，促進細胞損傷，促進炎性因子的釋放，通過提高miR-148a的表達，可提高細胞的活性，降低細胞的損傷，減少炎性因子的釋放，對細胞起到一定的保護作用。

自噬是一個受調(diào)控的過程，是一種程序性細胞死亡的形式，其在許多疾病中也起著重要作用，大量的研究也顯示，自噬參與AP的發(fā)生發(fā)展過程[14-16]。而眾多的微小RNA也可通過調(diào)節(jié)細胞的自噬參與多種疾病的發(fā)病過程[17- 20]。鄭紹越等人的研究顯示，轉(zhuǎn)染miR- 383 類似物后，細胞中Beclin1表達水平及 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值下調(diào)，miR- 383可以降低急性胰腺炎時細胞自噬水平[3]，而miR-148a是否可通過調(diào)節(jié)細胞的自噬參與AP中腺泡細胞的損傷?

本研究中，我們的實驗結(jié)果顯示，AP模型組細胞中Beclin1的表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率顯著高于正常對照組，而miR-148a mimics組細胞中Beclin1的表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率顯著低于模型組，這就提示，提高模型細胞中miR-148a 的表達后，可抑制自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比率，抑制自噬過程，這也與Miao B等人的實驗結(jié)果相一致[11]。

綜上所述，miR-148a可通過抑制AP過程中腺泡細胞的自噬，減少促炎因子的釋放，減輕細胞損傷，提高細胞活性，從而發(fā)揮對細胞的保護作用。