siRNA-ATF3表達(dá)載體對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞U373MG的作用研究

馬斯奇 孫逸杰 朱旭強(qiáng) 李雪元 吳立新 閆東明

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是發(fā)生最為廣泛且最具惡性的一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）腫瘤，在所有神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤（gliomas）中，其占比為60%，每10萬人中5人患病，預(yù)后差，即便實(shí)施積極的綜合干預(yù)，基本每個(gè)GBM患者皆會(huì)復(fù)發(fā)，其后的中位生存期只有5～7個(gè)月［1-3］。因此，探討GBM形成、發(fā)展，還有遷移、侵襲的相關(guān)機(jī)制備受醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重視。本研究制備siRNA-ATF3表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染U373MG細(xì)胞株，以熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)篩選出有效的siRNA-ATF3表達(dá)載體，以免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA-ATF3表達(dá)載體的U373MG細(xì)胞株中ATF3、Maspin和MMP2的蛋白表達(dá)量，旨在分析在GBM組織形成、進(jìn)行、遷移、浸侵與預(yù)后評(píng)估方面，MMP2、Maspin與ATF3所發(fā)揮的影響，為臨床治療GBM開辟新路徑。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料采用上海細(xì)胞生物研究所和美國(guó)Invitrogen公司分別購(gòu)得U373MG細(xì)胞株和純化質(zhì)粒pSilencer。胰蛋白酶、限制性內(nèi)切酶（HindⅢ、BamHⅠ）、質(zhì)粒超純提取試劑盒、連接試劑盒、去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒、小量提取質(zhì)粒試劑盒、LipofectmineTM2000、RNA提取試劑Trizol和熒光定量PCR試劑盒均為Invitrogen公司（USA）產(chǎn)品，質(zhì)粒超純提取試劑盒、細(xì)胞裂解液和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)研究所，TaqDNA聚合酶購(gòu)自日本Takara公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTPCR）引物由中國(guó)上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 U373MG細(xì)胞中ATF3 siRNA的構(gòu)建、篩選與鑒定

1.2.1.1 表達(dá)載體pSilencer/siRNA-ATF3的構(gòu)建：參考相關(guān)研究成果，同時(shí)借助設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)合成得到3對(duì)63 bp充分互補(bǔ)的序列，兩端分布著BamHⅠ與HindⅢ黏性末端識(shí)別序列，待停止退火，生成的雙鏈物質(zhì)在不依賴酶切下能夠?qū)崿F(xiàn)載體pSilencer2.1 U6的直接連入。

siR1：

5'-GATCCGAGC TGAGG TTTGCCATCCTTCAA GAGAGGATGGCAAACCTCAGCTCTTTTTTGGAA-3'，

5'-AGCTTTTCCAAAAAAGAGCTGAGGTTTGCC ATCCTCTCTTGAAGGATG GCAAACCTCAGCTCG-3'；

siR2：

5'-GATCCGAGGCGA CGAGAAAGAAATTT CAA GAGAATTTCTTTCTCGTCGCCTCTTTTTTGGAAA-3'，

5'-AGCTTTTCC AAAA AAGAGGCGACGAGAA AGAAATTCTTGAAATTTCTTTCTCGTCGCCTCG-3'；

siR3：

5'-GATCCGAAGAAGGAGAAGACGGAGTTCAA GAGACTCCGTCTTCTCCTTCTTCTTTTTTGGAAA-3'，

5'-AGCTTTTCCAAAAAAGAAGAAGGA GAA G ACGGAGTCTCTTGAACTCCGTCTTCTCCTTCTTCG-3'

由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。退火片段與pSilencer2.1 U6載體連接反應(yīng)、酶切，在1%瓊脂糖凝膠中上樣酶切產(chǎn)物、電泳，膠塊回收，按照說明書嚴(yán)格開展各項(xiàng)操作。回收載體定量，DNA連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，借助小量提取質(zhì)粒技術(shù)，完成對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)物內(nèi)質(zhì)粒的提取，之后為鑒定酶切產(chǎn)物操作。

1.2.1.2 在U373MG細(xì)胞中檢測(cè)前體表達(dá)載體干擾表現(xiàn)

1.2.1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染：先行細(xì)胞復(fù)蘇處理，同時(shí)對(duì)細(xì)胞量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，再移至培養(yǎng)箱（100%濕度、5%CO2、37℃）內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞回縮、間隙變大，細(xì)胞開始變圓時(shí)，培養(yǎng)液終止消化。1 000 r/min離心5 min，在新培養(yǎng)瓶里內(nèi)轉(zhuǎn)移種植，2～3 d后達(dá)到80%～90%的細(xì)胞匯合度，開始進(jìn)入傳代環(huán)節(jié)。按轉(zhuǎn)染試劑盒步驟嚴(yán)格操作。轉(zhuǎn)染后24 h后求解轉(zhuǎn)染效率（=表達(dá)熒光的細(xì)胞量/總細(xì)胞量×100%）。

1.2.1.2.2 RT-PCR和Western blot檢測(cè)檢測(cè)pSilencer/siR-ATF3表達(dá)載體對(duì)ATF3表達(dá)水平的影響：RTPCR引物序列如下：正向序列：5’CCTCGGAAGT GAGTGCTTCT3’；反向序列：5’ATGGCAAACCTCAG CTCTTC3’。細(xì)胞的裂解、凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜、封閉、結(jié)合一抗、結(jié)合二抗，化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)，顯影。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)：轉(zhuǎn)染加藥后細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定30 min，Triton X-100（0.25%）于室溫中對(duì)標(biāo)本實(shí)施10 min孵育；室溫中，通過動(dòng)物血清（10%）行0.5 h封閉處理，一抗4℃過夜，二抗室溫下1 h（或37℃，30 min）；DAB顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明20 min，中性樹膠封固。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組：共分為5組：①Cell組：未進(jìn)行處理；②Control-siRNA組：實(shí)施siRNA寡NT（核苷酸）片段轉(zhuǎn)染操作；③ATF3-siRNA組：實(shí)施ATF3-siRNA干擾片段轉(zhuǎn)染操作；④順鉑（DDP）組：用DDP干預(yù)；⑤ATF3-siRNA+DDP組：先進(jìn)行ATF3-siRNA轉(zhuǎn)染，再用DDP干預(yù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)分析工具為SPSS 23.0，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，通過t檢驗(yàn)分析2組間兩樣本均數(shù)，通過方差分析（ANOVA）對(duì)比分析多組間兩樣本均數(shù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組ATF3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較RT-PCR測(cè)定pSilencer/siR-ATF3影響ATF3表達(dá)量，各組ATF3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平由大至小的排序?yàn)閟iRControl組＞細(xì)胞組＞siR3-ATF3組＞siR1-ATF3組與siR2-ATF3組；對(duì)比siR1-ATF3組、siR2-ATF3組未見顯著差別（P>0.05），剩余各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。pSilencer siR1-ATF3、siR2-ATF3表達(dá)載體能夠使基因ATF3于細(xì)胞U373MG內(nèi)的mRNA表達(dá)量顯著減少（圖1）。

圖1各組ATF3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Figure 1 Comparison of the relative expression of ATF3 mRNA in each group

2.2Western blot測(cè)定表達(dá)載體p Silencer/siRATF3影響ATF3表達(dá)量在ATF3相對(duì)表達(dá)水平方面，由低至高的排序?yàn)閟iR1-ATF3組、siR2-ATF3組＜細(xì)胞組、siR3-ATF3組與siR-Control組。對(duì)比siR1-ATF3組、siR2-ATF3組未見顯著差異（P>0.05），對(duì)比另3組也未見顯著差異（P>0.05），其余各組兩兩對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。表達(dá)載體pSilencer siR1-ATF3、siR2-ATF3能夠使細(xì)胞U373MG內(nèi)基因ATF3的蛋白表達(dá)量顯著減少（圖2～3）。

圖2 各組ATF3蛋白表達(dá)情況Figure 2 ATF3 protein expression in each group

圖3 各組ATF3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Figure 3 Comparison of the relative expression of ATF3 protein in each group

參考RT-PCR以及WB結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，pSilencer siR1-ATF3、pSilencer siR2-ATF3表達(dá)載體能夠使細(xì)胞U373MG內(nèi)ATF3基因的表達(dá)量顯著減少。

2.3干預(yù)后U373MG細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化借助倒置顯微鏡能夠觀察到，干預(yù)后2 d，Control-siRNA組及Cell組皆呈現(xiàn)為良好的細(xì)胞生長(zhǎng)情況，呈現(xiàn)出清晰的細(xì)胞輪廓，細(xì)胞高密度分布，貼壁生長(zhǎng)；但另3個(gè)組均呈現(xiàn)出不良的細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一些細(xì)胞含顆粒量提升，細(xì)胞為圓狀，并呈浮起表現(xiàn)，細(xì)胞散在分布，大量碎片分布于細(xì)胞附近，細(xì)胞增殖速率下降（圖4）。

圖4 干預(yù)前后U373MG細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（400×），A、B分別所示為細(xì)胞U373MG的正常形態(tài)、干預(yù)后細(xì)胞U373MG的形態(tài)Figure 4 U373MG cell morphology before and after treatment（400×）.A：The normal morphology of U373MG cells；B：The morphology of U373MG cells after treatment

2.4干預(yù)后免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定MMP-2、ATF3與Maspin的表達(dá)量

2.4.1 各組ATF3的表達(dá)與分布：細(xì)胞核以及細(xì)胞漿內(nèi)皆存在ATF3蛋白陽(yáng)性表達(dá)現(xiàn)象，就蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞量而言，空白組、Control-siRNA組對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；相較于Control-siRNA組、空白組，另3組皆呈顯著偏低表現(xiàn)（P＜0.05）；由多至少的排序?yàn)镈DP組＞ATF3-siRNA組＞ATF3-siRNA+DDP組，3組間兩兩對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5、8。

圖5 5組ATF3的表達(dá)（400×），陽(yáng)性表達(dá)即黃色顆粒A：Cell組；B：Control-siRNA組；C：ATF3-siRNA組；D：順鉑組；E：ATF3-siRNA+順鉑組Figure 5 The expression of ATF3 in each experimental group（400×），yellow particles are positive expression.A：Cell group；B：Control-siRNA group；C：ATF3-siRNA group；D：Cisplatin group；E：ATF3-siRNA+cisplatin group

2.4.2 Maspin在各實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)及分布情況：此蛋白的表達(dá)場(chǎng)所以U373MG胞漿為主，也有小部分可見于胞核內(nèi)。在陽(yáng)性細(xì)胞量上，空白組、Control-siRNA組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽(yáng)性細(xì)胞量最多的為ATF3-siRNA組，其和Control-siRNA組、空白組對(duì)比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；相較于空白組、Control-siRNA組，DDP與ATF3-siRNA+DDP組皆呈顯著偏少（P＜0.05）；DDP組、ATF3-siRNA組、ATF3-siRNA+DDP組兩兩對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6、8。

2.4.3 各實(shí)驗(yàn)組MMP2蛋白的表達(dá)和分布：細(xì)胞U373MG的胞漿與胞核內(nèi)皆存在MMP2陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)，在陽(yáng)性細(xì)胞量上，空白組與Control-siRNA組對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；相較于Control-siRNA組與空白組，另3組呈顯著偏少（P＜0.05）；陽(yáng)性細(xì)胞量由多至少的排序?yàn)镈DP組、ATF3-siRNA組、ATF3-siRNA+DDP組，3組兩兩對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖7～8。

圖6各實(shí)驗(yàn)組Maspin的表達(dá)（400×），陽(yáng)性表達(dá)即黃色顆粒A～E依次所指為Cell組、Control-siRNA組、ATF3-siRNA組、DDP組、ATF3-siRNA+DDP組Figure 6 Maspin expression in each experimental group（400×），yellow particles are positive expression.A：Cell group；B：Control-siRNA group；C：ATF3-siRNA group；D：Cisplatin group；E：ATF3-siRNA+cisplatin group

圖7各實(shí)驗(yàn)組MMP2的表達(dá)（400×），陽(yáng)性表達(dá)即黃色顆粒A～E依次所指為Cell組、Control-siRNA組、ATF3-siRNA組、DDP組、ATF3-siRNA+DDP組Figure 7 The expression of MMP2 in each experimental group（400×），yellow particles are positive expression A：Cell group；B：Control-siRNA group；C：ATF3-siRNA group；D：Cisplatin group；E：ATF3-siRNA+cisplatin group

2.4.4 ATF3、MMP-2與Maspin蛋白表達(dá)陽(yáng)性率對(duì)比：由圖8可知，在MMP2與ATF3蛋白表達(dá)量上，5組基本相當(dāng)，其中陽(yáng)性表達(dá)率最高的為空白組、Control-siRNA組，二者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；順鉑組其次，ATF3-siRNA組次之，最低的為ATF3-siRNA+DDP組。在Maspin蛋白陽(yáng)性率方面，ATF3-siRNA組＞Control-siRNA組與空白組＞DDP組＞ATF3-siRNA+DDP組。

圖8 5組ATF3、Maspin和MMP-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較Figure 8 Comparison of the positive rate of ATF3，Maspin and MMP-2 protein expression in each experimental group

3 討論

ATF3參與人體內(nèi)諸多生理功能，含細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、修復(fù)損傷、細(xì)胞凋亡途徑、細(xì)胞黏附等［4-6］。很大部分細(xì)胞內(nèi)ATF3表達(dá)量皆相對(duì)較低，但當(dāng)細(xì)胞受到多種細(xì)胞外信號(hào)刺激時(shí)其表達(dá)大大增加［7］。研究證實(shí)，ATF3具備致癌性，可使細(xì)胞增殖速度提升，在諸多不同惡性腫瘤組織內(nèi)均有過表達(dá)現(xiàn)象發(fā)生，與惡性腫瘤的遷移、浸侵及預(yù)后皆存在密切聯(lián)系［8］。HUANG等［9］研究表明ATF3過度表達(dá)可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞PC-3的能動(dòng)性及侵襲性。YIN等［10］發(fā)現(xiàn)，受到TGFp的誘導(dǎo)，人BC細(xì)胞內(nèi)ATF3呈表達(dá)上調(diào)表現(xiàn)，之后會(huì)經(jīng)由增強(qiáng)Snail、Slug等侵襲，加速因子轉(zhuǎn)錄，對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行抑制，同時(shí)對(duì)癌細(xì)胞遷移施以促進(jìn)作用。ISHIGURO等［11］發(fā)現(xiàn)于HT29人克隆癌細(xì)胞內(nèi)，反義ATF3寡NT表達(dá)能夠使細(xì)胞侵襲、細(xì)胞黏附受抑，削弱HT29異種移植物的生長(zhǎng)，促進(jìn)感染小鼠存活率提升。JANZ等［12］經(jīng)由敲除小干擾RNA途徑，使ATF3功能喪失，能夠?qū)540Cy與L428霍杰金淋巴瘤（HL）細(xì)胞變異與增殖施以有效抑制。前期研究［13］表明，ATF3低表達(dá)于正常腦組織內(nèi)，但與Ⅰ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤（GBMLGG）內(nèi)ATF3表達(dá)與GBMLGG的病理分級(jí)呈正相關(guān)，證實(shí)ATF3過表達(dá)與GBMLGG演進(jìn)、惡性水平存在緊密聯(lián)系。沉默ATF3基因抑制了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U373MG的增殖，削弱細(xì)胞活性、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中明顯縮小了裸鼠移植瘤的體積。這些研究均表明ATF3表達(dá)促進(jìn)了人癌細(xì)胞的增殖，沉默ATF3基因可有效抑制腫瘤發(fā)展、侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了ATF3-siRNA后，U373MG形態(tài)出現(xiàn)變化，一些腫瘤細(xì)胞呈圓形，并浮起，各細(xì)胞松散分布，增殖速率減慢，可發(fā)現(xiàn)顆粒于細(xì)胞內(nèi)的含量增大，碎片分布于細(xì)胞附近的量也增多，與未實(shí)施ATF3-siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)相比，U373MG生長(zhǎng)變得不良。由此可見，對(duì)于GBM的U373MG株增生，ATF3-siRNA具抑制作用。ATF3-siRNA組、DDP組以及ATF3-siRNA+DDP組內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞量，相較另2組皆呈偏少，在陽(yáng)性細(xì)胞量方面，DDP組最多，其次為ATF3-siRNA組，最低的是ATF3-siRNA+DDP組，3組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明siRNA-ATF3表達(dá)載體能有效抑制U373MG細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，順鉑可協(xié)同減少ATF3的表達(dá)。

研究表明Maspin是一種抑癌基因，常高表達(dá)于多種正常人體組織，但在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)或不表達(dá)，常暗示預(yù)后不良［14-16］。MMP2是一種促癌基因，高表達(dá)于多種惡性腫瘤組織，如宮頸癌、腦GBMLGG、BC、肺癌、胰腺癌（PAAD）、結(jié)腸癌與肝癌等，此基因?qū)δ[瘤新生血管的產(chǎn)生具促進(jìn)作用，可使腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移灶產(chǎn)生速度提升［17-18］。前期實(shí)驗(yàn)［13］顯示，在正常腦組織內(nèi)Maspin蛋白與mRNA表達(dá)量皆較高，MMP2表達(dá)量皆偏低，但在Ⅰ～Ⅳ級(jí)GBMLGG內(nèi)Maspin表達(dá)水平較低，其表達(dá)在病理級(jí)別增加下不斷下降，其表達(dá)與GBMLGG病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，MMP2的表達(dá)逐級(jí)增強(qiáng)，且其表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)呈正相關(guān)，與其他學(xué)者研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默ATF3基因后，U373MG細(xì)胞株中MMP2陽(yáng)性表達(dá)與ATF3表達(dá)相當(dāng)，在陽(yáng)性細(xì)胞量上，相較于空白組、Control-siRNA組，另3組皆偏少，最多的為DDP組，其次為ATF3-siRNA組，相對(duì)最少的為ATF3-siRNA+DDP組，3組間兩兩對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明siRNA-ATF3表達(dá)載體可減少M(fèi)MP2表達(dá)，順鉑可協(xié)同進(jìn)一步減弱MMP2的表達(dá)；與空白組和Control-siRNA組相比，Maspin在ATF3-siRNA組表達(dá)最高，在順鉑組和ATF3-siRNA+順鉑組中的表達(dá)降低，說明siRNA-ATF3表達(dá)載體可增加Maspin表達(dá)。

本研究表明ATF3、Maspin和MMP2可能協(xié)同參與了U373MG細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生、進(jìn)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中可能存在ATF3和MMP2的相互調(diào)節(jié)、相互協(xié)同機(jī)制，而Maspin則抑制了其進(jìn)展，同時(shí)siRNA-ATF3表達(dá)載體可作為治療抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)增殖的一種有效手段。