基于Wnt/β-catenin通路研究麝香保心丸對冠心病心力衰竭大鼠的作用*

黃菲菲，王輝，高翔，黃仲略，蘇華俊，曹建雷

1.武漢市蔡甸區人民醫院，湖北 武漢 430100； 2.武漢大學中南醫院，湖北 武漢 430000

心力衰竭是指心臟舒張或收縮功能障礙，不能充分排出靜脈回心血量，導致動脈血液灌注不足，靜脈血液淤積，繼而引發心臟循環障礙。心力衰竭不是一種獨立的疾病，而是各類心臟疾病發展的終末階段。心肌重構是心力衰竭的重要病理機制，主要表現有心肌纖維化、心腔擴大、心肌肥厚等[1-2]。研究表明，心力衰竭發生時會伴隨心肌細胞凋亡，該癥狀與心肌細胞氧化應激損傷、線粒體功能障礙有密切關聯[3-5]。心肌細胞的氧化應激反應越強，機體抗氧化能力越弱，氧化還原失衡就越嚴重。線粒體功能障礙可能導致氧化磷酸化不足，從而增加氧化應激中間產物，加強對心肌細胞的損害，其動力學平衡機制可能與Wnt/β-catenin通路相關[6]。因此，探索心肌損傷發生的主要機制并研究保護心臟功能的相關藥物一直是臨床研究的一項重要課題。麝香保心丸是心內科臨床常用藥物，具有改善冠狀動脈血流量，減輕心肌纖維化等功效，同時可以強心益氣，改善患者的心功能[7]，但具體作用機制尚不明確。本研究旨在觀察麝香保心丸對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心力衰竭心肌損傷、心肌細胞氧化應激的影響，并探究其作用機制。

1 材料

1.1 動物90只健康雄性SD大鼠，體質量240～260 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，合格證號：SYXK(川)2014-189。飼養于室溫22～24 ℃，相對濕度50%，自然光照，自由飲水。

1.2 藥物與試劑麝香保心丸(上海和黃藥業有限公司，批號：101435)；卡托普利片(石家莊科迪藥業有限公司，批號：2015526)。腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)試劑盒(上海奧陸生物科技有限公司，批號：F8185-A)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：SNM536-VFE)；活性氧(reactive oxygen species，ROS)試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司，貨號：JKSJ-1834)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司，貨號：JKSJ-1892)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司，貨號：JKSJ-1821)；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司，貨號：JK-2396)；PrimeScriptTM RT reagent Kit(日本TaKaRa，批號：RR420A)；戊巴比妥鈉(上海紫一試劑廠，貨號：57-33-0)；40 ng·L-1多聚甲醛(西安百螢生物科技有限公司，貨號：20010)；蛋白酶K(美國 Sigma-Aldrich公司，貨號：3450-01-6)。

1.3 儀器ALC-V8S型小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)；FX7202型心電圖機(日本福田)；Vevo2011型小動物超聲實時影像系統(加拿大Visual Sonics公司)；ES-2型紫外分光光度儀(日本Malcom公司)；LightCycler 2.0型PCR儀(羅氏設備有限公司)；DM3000型光學顯微鏡(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 大鼠造模與分組大鼠適應性喂養1周，隨機選擇15只大鼠為假手術組，其余75只大鼠復制心力衰竭模型。腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)對大鼠進行麻醉，將其仰臥位固定在手術臺上，在大鼠頸部做一切口進行插管并連接動物呼吸機，四肢皮下插入動物機能電極，進行心電監測，然后結扎左冠狀動脈前降支，心電圖顯示T波增高甚至與QRS波融合視為造模成功[8-9]。假手術組僅切開胸膛，但不結扎左冠狀動脈前降支。造模4周后對大鼠進行分組，剔除造模失敗大鼠，各組均保留14只，隨機分為卡托普利(135 mg·kg-1)組、麝香保心丸(低、中、高劑量)(25 mg·kg-1、50 mg·kg-1、75 mg·kg-1)組與模型組。假手術組、模型組用相應體積的生理鹽水進行灌胃，每日1次，連續治療4周。

2.2 觀察指標

2.2.1 心臟形態學的檢測采用小動物超聲實時影像系統檢測大鼠心臟體積變化情況。將大鼠固定在解剖臺上并用異氟烷進行麻醉，對大鼠進行心臟定位，并通過M模式超聲評價大鼠心臟功能。檢測大鼠左心室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVDd)、左心室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic dimension，LVDs)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)、左心室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume，LVESV)，所有數據均選取3個測量值的平均值。

2.2.2 血漿BNP水平的檢測每組隨機選擇10只大鼠，用含EDTA的抗凝管進行腹主動脈取血，靜置30 min后，離心(3 500 r·min-1，10 min)，取上清，采用放射免疫法檢測血漿BNP水平。

2.2.3 心臟質量指數(total heart mass index，HWI)的測定取血后，打開大鼠腹腔，摘取大鼠心臟，并用濾紙吸干水分，稱取心臟質量(heart mass，HM)，并計算HWI[HWI=HM/體質量(body mass，BM)]。

2.2.4 心肌病理組織學變化每組隨機選擇3只大鼠，取心臟，浸入40 ng·L-1多聚甲醛溶液中，24 h 后按常規方法進行脫水，脫水處理后用石蠟包埋，切片(厚度約5 μm)；放置于二甲苯溶液中浸泡10 min，取出，再次更換二甲苯浸泡 10 min，取出，放置于50%二甲苯浸泡5 min，將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數分鐘，酸水及氨水中分色10 s，流水沖洗1 h后入蒸餾水片刻，70%和90%乙醇中脫水各10 min，入伊紅染色液染色 2 min，經100%乙醇脫水，再經二甲苯使切片透明，并鏡檢拍照。

2.2.5 心肌細胞凋亡指數的檢測將上述HE染色的蠟塊，采用TUNEL法按照試劑盒說明書執行各項操作。切片滴加20 ng·L-1蛋白酶K，20 min后，用PBS(pH7.4)洗3次，每次5 min，加3%小牛血清白蛋白和20%小牛血清，15 min后，滴加反應液 50 μL，置濕盒內，37 ℃放置1 h，加0.01 mol·L-10.3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，采用PBS(pH7.4)洗3次，每次5min，加3%小牛血清白蛋白、1%封阻劑和20%小牛血清孵育15 min，滴加 12稀釋的POD(HRP連結的抗熒光素抗體) 20 μL孵育30 min，采用PBS(pH 7.4)洗3次，每次 5 min，鏡檢細胞核棕褐色即為陽性，每個標本鏡檢5張切片，AI=凋亡細胞核/總細胞核數。

2.2.6 心肌細胞氧化應激指標的檢測ROS檢測：①將大鼠(假手術組、模型組、卡托普利組、麝香保心丸低劑量組、麝香保心丸中劑量組、麝香保心丸高劑量組，每組8只)部分心肌組織剪碎，并用PBS漂洗。之后加入消化酶，在37 ℃恒溫水浴鍋中水浴加熱 20 min，300目過篩，離心(離心半徑8 cm，3 000 r·min-1，5 min)，PBS漂洗2次，制備單細胞懸液，加入DCFH-DA稀釋液(100 μL，1500)，37 ℃ 孵育 1 h，PBS漂洗；通過化學熒光法檢測ROS。②MDA、SOD、GSH-Px檢測：取上述各組大鼠部分心肌細胞剪碎，加入PMSF混合液與Lysis buffer(800 μL)，離心(離心半徑8 cm，12 000 r·min-1，10 min，4 ℃)，取上清液BCA定量，并通過Excel繪制標準曲線計算蛋白濃度，MDA、SOD、GSH-Px檢測步驟參考試劑盒說明書。

2.2.7 Wnt/β-catenin通路相關基因水平的檢測每組隨機選擇3只大鼠，取心臟，通過Trizol法提取RNA，沉降、洗滌、重懸后反轉錄cDNA，采用紫外分光光度計檢測RNA含量。擴增體系20 μL，預變性95 ℃30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 34 s，延伸95 ℃ 15 s，循環40次。LRP6引物：上游5′-CGTCTACTGGACGGACGATG-3′，下游5′-GGTCCCATTGAGCCTTGTCA-3′，長度187 bp；GSK-3β上游 5′-GGGACAGTGGTGTGGATCA-3′，下游5′-GCCGAAAGACCTTCGTCCAA-3′，長度144 bp；3β-catenin上游5′-ATCATTCTGGCCAGTGGTGG-3′，下游5′-GACAGCACCTTCAGCACTCT-3′，長度104 bp。每個樣本3個復孔，并通過2-△△CT法計算其表達量。

3 結果

3.1 大鼠心臟超聲心動圖的測定與假手術組比較，模型組大鼠LVDs、LVDd、LVESV、LVEDV均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，麝香保心丸組低、中、高劑量組及卡托普利組大鼠LVDs、LVDd、LVESV、LVEDV均明顯下降(P<0.05，P<0.01)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠心臟超聲心動圖結果比較

注：假手術組；B：模型組；C：卡托普利組；D：麝香保心丸低劑量組；E：麝香保心丸中劑量組；F：麝香保心丸高劑量組圖1 各組大鼠心臟超聲心動圖

3.2 大鼠血漿BNP水平的測定與假手術組比較，模型組大鼠血漿BNP水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，麝香保心丸低、中、高劑量組及卡托普利組大鼠血漿BNP水平顯著下降(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血漿BNP水平比較

3.3 大鼠心臟質量指數的測定與假手術組比較，模型組大鼠HWI、LVMI均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，麝香保心丸低、中、高劑量組及卡托普利組大鼠HWI、LVMI均顯著下降(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠心臟質量指數比較

3.4 大鼠心肌細胞HE染色及心肌細胞凋亡指數的測定假手術組大鼠心肌細胞排列整齊、結構規則，心肌纖維完整，未出現變形壞死；模型組大鼠心肌細胞排列紊亂、形態各異，部分心肌纖維變形；麝香保心丸低、中、高劑量組及卡托普利組大鼠心肌細胞受損程度明顯低于模型組，心肌細胞排列較為整齊。見圖2。

與假手術組比較，模型組大鼠心肌細胞AI顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，麝香保心丸低、中、高劑量組及卡托普利組大鼠心肌細胞AI顯著下降(P<0.01)。見圖3、表4。

表4 各組大鼠心肌細胞凋亡指數比較

注：假手術組；B：模型組；C：卡托普利組；D：麝香保心丸低劑量組；E：麝香保心丸中劑量組；F：麝香保心丸高劑量組圖2 大鼠心肌細胞病理學結果(HE，×200)

注：假手術組；B：模型組；C：卡托普利組；D：麝香保心丸低劑量組；E：麝香保心丸中劑量組；F：麝香保心丸高劑量組圖3 大鼠心肌細胞凋亡(×200)

3.5 大鼠心肌組織氧化應激指標的測定與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織ROS、MDA水平顯著升高(P<0.01)，SOD、GSH-Px水平顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，麝香保心丸低、中、高劑量組及卡托普利組大鼠心肌組織ROS、MDA水平均顯著降低(P<0.01)，SOD、GSH-Px水平均顯著升高(P<0.01)。見圖4、表5。

表5 各組大鼠心肌細胞氧化應激指標比較

3.6 對大鼠心肌組織LRP6mRNA、GSK-3βmRNA、3β-cateninmRNA水平的影響與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織LRP6mRNA、GSK-3βmRNA、3β-cateninmRNA水平均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，麝香保心丸低、中、高劑量組及卡托普利組大鼠心肌組織LRP6mRNA、GSK-3βmRNA、3β-cateninmRNA水平均顯著降低(P<0.01)。見表6。

表6 對大鼠LRP6 mRNA、GSK-3β mRNA、3β-catenin mRNA水平的影響

注：A：假手術組；B：模型組；C：卡托普利組；D：麝香保心丸低劑量組；E：麝香保心丸中劑量組；F：麝香保心丸高劑量組圖4 大鼠心肌細胞ROS流式圖

4 討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心力衰竭是臨床常見的心血管疾病，患者的心輸出量下降導致機體靜脈回流不暢[10-12]。在心力衰竭疾病進程中，心肌結構的改變是導致疾病惡化的關鍵因素。抑制、緩解心室重構是治療心力衰竭的關鍵所在[13-14]。中醫藥在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心力衰竭中運用較為廣泛，麝香保心丸是由《太平惠民和劑局方》中的蘇合香丸衍生而來的中成藥，在臨床中應用十分廣泛，主要用于治療心功能不全、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等心腦血管疾病[15]。研究發現，麝香保心丸具有改善心肌重構、擴張冠狀動脈、減輕心肌纖維化、改善冠狀動脈血管痙攣、促進缺血心肌局部微循環、保護血管內皮細胞等[16]。

心臟等重要靶器官缺氧缺血會造成能量代謝紊亂，機體可通過中性粒細胞呼吸爆發、產生黃嘌呤氧化酶的途徑產生大量氧自由基[17-18]。機體抗氧化能力下降，導致心肌細胞等長期處于氧化應激狀態。自由基會加重對心臟的損傷并促進心肌纖維化進程，引發心室重構，進一步加重心功能障礙，發展為心力衰竭。有研究指出，β-catenin敲除可抑制心肌、細胞分化、防止心室重構，有利于改善心力衰竭患者的預后[19]。此外，Wnt也是驅動組織形態與結構變化的關鍵因素。提示心室重構與Wnt/β-catenin通路有密切關聯[20]。研究表明，Wnt/β-catenin通路與線粒體力學間關系密切，LRP6作為其中的關鍵紐帶，可激活分裂蛋白Drp1造成線粒體功能障礙，導致心功能不全、致死性擴張型心肌病等[21-22]。GSK-3β可作用于眾多轉錄因子與信號蛋白結構蛋白，在細胞中過度活化，促進細胞凋亡[23-24]。

本研究表明，麝香保心丸組可顯著降低大鼠血漿BNP水平。BNP是重要的神經激素，可反映心室擴張程度，BNP水平上升可增加心排出量以維持血容量的穩定，加重心力衰竭程度[25-26]。LVDs、LVDd、LVESV、LVEDV可有效反映大鼠的心臟結構，是判斷大鼠心室重構程度的有效觀察指標，結合心臟質量指數、超聲心動圖及心肌組織病理學檢查結果可知，麝香保心丸可有效抑制心室重構、減輕大鼠心肌纖維化程度、抑制心肌細胞凋亡。細胞凋亡是導致心力衰竭進一步惡化的關鍵因素，其發生機制可能與氧化應激、線粒體損傷有關[27-28]。當心肌細胞缺氧缺血之后，氧化應激水平能力明顯降低，導致ROS大量堆積，不飽和脂肪酸轉化為脂質過氧化物，中間產物MDA水平升高，機體氧化-抗氧化系統失衡，導致氧化應激反應擴散與心肌損傷。SOD與GSH-Px能夠將自由基轉變為無毒物質，減輕機體的氧化應激反應[29-30]。本研究發現，麝香保心丸可顯著減輕大鼠心肌細胞氧化應激反應，保護心肌細胞組織。同時，也可降低心肌組織LRP6mRNA、GSK-3βmRNA、3β-cateninmRNA水平，從而抑制心肌重構、減少細胞凋亡、保護線粒體功能。麝香保心丸在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心力衰竭大鼠的治療不亞于卡托普利片的治療效果。

綜上所述，麝香保心丸可有效緩解冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心力衰竭大鼠心室重構進程，減輕心肌細胞氧化應激反應，抑制心肌細胞凋亡，改善大鼠心功能，可能通過抑制Wnt/β-catenin通路有關，其治療效果顯著，值得進行推廣應用。