高效液相色譜法測定高油脂植物源性食品中紐甜含量

戴琨，公丕學，薛霞，趙慧男，劉艷明，祝建華

1.山東省食品藥品檢驗研究院（濟南 250101）；2.山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心（濟南 250101）

紐甜（neotame）是一種功能性甜味劑，特性優良，結構式如圖1所示，適合添加到多類食品中[1-5]。但人工合成甜味劑的安全性受到廣泛質疑，各國采取嚴格限制使用的政策[6-9]。GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中規定多類食品中紐甜的最大使用量[10]，如加工堅果和籽類的最大使用量為0.032 g/kg。高油脂植物源性食品是一類油脂含量高的植物性食品，如炒貨、薯片均屬于此類食品。

圖1 紐甜的化學結構

報道的紐甜檢測方法主要有高效液相色譜法[11-15]、液相色譜-質譜法[16-19]等，使用液質法檢測時，基質效應大，定量準確性不夠，液相法能對目標物進行準確定量。食品種類復雜多樣，對于基質復雜的樣品，需采取加沉淀劑[20-21]、固相萃取[22-24]等有效的處理方法。高油脂植物源性樣品基質復雜，處理過程選用固相萃取法以獲得較好的凈化效果，文獻報道使用較多的固相萃取（SPE）柱有C18、HLB等[22-24]，然而，處理高油脂類食品時此類SPE凈化效果不佳，因此選用一種合適的凈化方式處理此類食品很有必要。

試驗建立固相萃取凈化-高效液相色譜法測定高油脂植物源性食品中的紐甜含量。考察不同提取條件、凈化方式對該類食品中紐甜的提取和凈化效果的影響，以獲得操作簡便、定量準確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紐甜標準品（純度≥99%，曼哈格公司）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；醋酸銨（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸（優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；冰乙酸（優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；三乙胺（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；五香花生、糖炒花生、黑糖瓜子、奶油瓜子、薯片（均購于當地超市）。

混合提取液：分別吸取0.8 mL甲酸和2.5 mL三乙胺，加水定容至1 L。

UltiMate 3000型高效液相色譜儀（配有DAD檢測器，美國Thermo Fisher Scientific公司）；N-EVAP型控溫氮吹儀（美國Organomation公司）；ME2002T型電子天平（德國Mettler Toledo公司）；3-18KS型高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；MS-3基本型旋渦混合器（德國IKA公司）；SB-800DTD型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）；固相萃取柱、Waters Atlantis T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Waters公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 紐甜標準溶液的配制

準確稱取10.0 mg標準物質，用混合提取液溶解并準確定容至10.00 mL，充分搖勻，配制成1.00 mg/mL的標準儲備液，取適量標準儲備溶液，用混合提取液稀釋，制成質量濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 μg/mL的標準曲線系列工作溶液，于4 ℃保存備用。

1.2.2 樣品的前處理

1.2.2.1 樣品提取

時政熱點的選擇應該是正面向上的，要有積極的教育意義。青年學生長期在學校生活，對社會了解得不夠深入，有時面對未來的生活茫然不知所措，思想上往往有片面性和理想化的特點，有時還帶有主觀主義和個人主義傾向，價值觀的形成還不穩定，極易受到外界影響。因此，正面的時政熱點案例的使用尤為重要，這就要求教師要多給學生講授積極向上的話題，通過大量正面素材的教育幫助學生樹立正確的世界觀、人生觀、價值觀和堅定的政治立場、政治觀念，從而樹立起正確的政治方向。

試驗前處理優化過程中使用的樣品為能夠代表高油脂植物源性食品的五香花生，稱取5 g（精確到0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入20 mL 30%甲醇水溶液，渦旋分散混勻，超聲波清洗器中超聲提取20 min后，用離心機以8000 r/min的轉速冷凍離心5 min，將上清液轉移至另一支50 mL離心管中，用磷酸調節至pH 2后轉移至25 mL容量瓶中，定容待凈化。

1.2.2.2 樣品凈化

取PRiME MCX固相萃取柱，準確移取10 mL待凈化液過固相萃取柱，控制流速不超過1 mL/min，待液體流盡后用5 mL 100 mmol/L甲酸銨（含2%甲酸）溶液淋洗，用5 mL甲醇淋洗，將小柱抽干，用5 mL甲醇（含5%氨水）洗脫，收集的洗脫液經45 ℃氮吹至近干，用1 mL 50%甲醇水復溶，超聲10 min后，過0.22 μm微孔有機濾膜，濾液待上機檢測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱采用Atlantis T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動相流速0.8 mL/min；檢測波長210 nm；進樣體積10 μL。流動相A采用0.1%磷酸水溶液，流動相B采用乙腈，采用梯度洗脫程序，梯度條件見表1。

表1 流動相梯度程序

1.2.4 方法的線性范圍和檢出限

將紐甜標準曲線工作溶液按濃度由低到高依次經高效液相色譜儀進行分析測定，以紐甜標準工作溶液質量濃度（μg/mL）為橫坐標，以響應峰面積（mAU·min）為縱坐標，繪制紐甜標準工作曲線，根據信噪比計算方法的檢出限和定量限。

選用具有代表性的高油脂植物源性食品進行回收率和精密度試驗，實驗室檢測空白樣品為糖炒花生、黑糖瓜子、炸薯片，進行添加回收率和精密度試驗，以紐甜添加濃度0.2，2和10 mg/kg這3個水平，每個水平重復測定6次，分別計算回收率及相對標準偏差。

1.3 數據處理

通過儀器配套的Chromeleon 7軟件進行數據采集及色譜結果分析，采用Origin 8.0分析軟件進行數據處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的優化

2.1.1 提取溶液的選擇

試驗考察不同提取溶液對五香花生中紐甜提取效率的影響，紐甜添加濃度2 mg/kg。在用提取液提取過程中，樣品中油脂的大量存在會影響到樣品的分散及目標物的提取效果。選用混合提取液、甲醇水溶液、乙腈水溶液分別對樣品中紐甜進行提取，結果發現，用混合提取液提取時，提取液較渾濁，上層有較厚油脂層，難以除去，影響目標物的提取效率和回收率；加入乙腈水溶液進行提取時，樣品呈現糊狀，冷凍離心后不能分層；用甲醇水提取時，樣品混合均勻，冷凍離心后能夠分層，因此，選用甲醇水溶液作為樣品提取劑。試驗進一步考察5%，10%，20%，30%，40%和50%（V/V）甲醇水溶液的提取效果，結果如圖2所示。隨著甲醇比例提高，回收率升高，甲醇水溶液中甲醇體積分數大于30%時，回收率下降。由圖1可見，紐甜的結構中含有酯基，根據相似相溶原理，提高甲醇比例有利于提高回收率，而甲醇體積分數提高，提取液中油脂等雜質含量也隨之增加，干擾紐甜分離，影響定量。因此，選用30%甲醇水溶液作為提取溶劑。

圖2 不同比例甲醇水提取液對紐甜回收率的影響

2.1.2 凈化方式的選擇

由于高油脂食品基質復雜，樣品提取液中油脂較多干擾紐甜檢測，需要進行有效的凈化，并對目標物進行富集。固相萃取法快速、簡便、高效，因此，選用固相萃取柱對樣品提取液進行凈化處理。試驗比較HLB、C18、MCX、MAX、PRiME HLB、PRiME MCX這6種SPE柱的凈化效果，6種SPE柱的凈化方法見表2。

表2 6種SPE柱的凈化方法

經SPE柱凈化并濃縮后，上機檢測，樣品的加標回收率結果如圖3所示。結果表明，使用HLB、MCX、PRiME MCX柱時紐甜回收率較高，而使用C18、MAX、PRiME HLB柱時效果較差。在使用C18柱進行凈化時，同時比較甲醇水提取液和混合提取液的提取效率，回收率分別為40%和30%。由于樣品中脂肪、蛋白等雜質含量較高，甲醇水溶液的提取效率稍高一些，但C18柱不能有效地去除提取液中雜質，凈化效果較差，干擾較多且回收率較低。PRiME HLB柱是一種通用型的固相萃取柱，能去除磷脂、蛋白等雜質，但回收率較低，推測原因是對目標物有一定吸附。使用HLB柱時，回收率雖然較高，但上機檢測時雜質干擾較多，影響目標物的準確定量，且對不同種類的其他樣品使用時，凈化效果存在差異，有的樣品凈化后檢測，雜質峰的存在嚴重干擾目標物的定量，效果較差。使用MCX柱時，凈化步驟較復雜，上樣速率較低，且上機檢測時目標物附近干擾較多。而PRiME MCX是一款混合模式（反相和陽離子交換）固相萃取柱，雜質去除效果較好，干擾少，回收率高，對各種樣品效果均較好，且不需活化，因此，選用PRiME MCX柱凈化該類樣品，能夠提高檢測的靈敏度和準確性。

圖3 紐甜通過不同SPE柱的回收率

2.1.3 上樣液pH的選擇

PRiME MCX是反相和離子交換混合模式固相萃取柱，紐甜的結構中含有亞氨基和羧基，屬于兩性化合物，上樣液的pH會影響紐甜的存在形式，從而影響與SPE柱固定相的結合效率。因此，試驗考察上樣液pH對紐甜回收率的影響，將樣品待凈化液分別調節至pH 1，2，3，5，7和9后，過柱凈化，回收率如圖4所示。結果顯示，pH 2時，回收率較高；pH 1時，回收率與pH 2時的回收率相當，隨著pH升高，回收率逐漸下降，在酸性條件下，紐甜帶上正電荷，更易與柱子固定相結合，且更能有效地去除干擾雜質，從而能夠提高目標物的回收率。考慮到環保因素及試驗的操作簡便性，選擇上樣液pH 2。

圖4 上樣液pH對紐甜回收率的影響

2.1.4 洗脫條件的優化

由于PRiME MCX柱基于強陽離子交換和反相吸附的功效，洗脫液選用含5%氨水的甲醇，將目標物從SPE柱上有效地洗脫下來，試驗考察洗脫液體積對紐甜回收率的影響，在凈化時，分別用1，3，5，7和9 mL含5%氨水的甲醇洗脫，紐甜回收率如圖5所示。結果表明，洗脫液體積5 mL時，目標物被完全洗脫，繼續增大洗脫液體積，氮吹濃縮時間延長，而回收率略有下降，因此，確定洗脫液體積為5 mL。

圖5 不同體積洗脫液對紐甜回收率的影響

2.2 色譜條件的選擇

試驗比較XBridge C18和Atlantis T3色譜柱對樣品中紐甜的分離，結果發現在分離復雜基質樣品中紐甜時，Atlantis T3的保留更強，更易于目標物和雜質的分離，因此，選用Atlantis T3色譜柱進行檢測，由于紐甜的最大吸收波長在210 nm左右，而甲醇的截止波長210 nm左右，乙腈的截止波長為190 nm左右，在用DAD檢測器檢測時，乙腈能降低基線噪音，減少干擾，且洗脫能力較強。因此，選用乙腈作為流動相。試驗比較0.1%磷酸水溶液、0.1%乙酸水溶液體系作為流動相分離目標物，由于試驗中涉及的基質較復雜，含有較多雜質，采用梯度洗脫條件可以提高目標物分離度、改善峰形，而用乙酸溶液進行洗脫時，基線漂移較嚴重，磷酸溶液作為流動相，基線較穩定，在低波長下，產生的基線波動較小，因此，采用含0.1%磷酸的水溶液作為流動相。在此色譜條件下，紐甜的標準物質色譜圖、陽性樣品色譜圖見圖6和圖7。

圖6 紐甜標準溶液（5 μg/mL）的高效液相色譜圖

圖7 陽性樣品的高效液相色譜圖

2.3 方法的線性范圍和檢出限

以紐甜標準工作溶液質量濃度為橫坐標，以響應峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，在0.5～100.0 μg/mL的質量濃度范圍內，回歸方程為y=0.2497x+0.0018，線性相關系數為0.9999，線性良好。以信噪比S/N為3計算得到檢出限，結果為0.06 mg/kg，以信噪比S/N為10計算得到定量限，結果為0.2 mg/kg。

2.4 方法的回收率和精密度

按上述條件進行空白樣品的添加回收率和精密度試驗，所得到的平均回收率及相對標準偏差結果見表3。

表3 添加回收率與精密度（n=6）

結果表明，紐甜的平均回收率在90%～96%，δRSD在0.9%～1.9%，該方法能夠滿足實際樣品的檢測需要。

2.5 實際樣品分析

采用建立的方法對50批次不同種類市售炒貨食品進行紐甜的檢測，其中2個批次樣品中檢出紐甜，分別為五香奶油花生（紐甜含量4.0 mg/kg）和焗鹽味瓜子（紐甜含量10 mg/kg），均低于GB 2760—2014中規定的限量要求。

3 結論

建立高效液相色譜結合固相萃取法檢測高油脂植物源性食品中紐甜含量的分析方法。以甲醇水溶液為提取劑對樣品中的紐甜進行提取，通過考察不同固相萃取凈化方法的效果，最終選用PRiME MCX固相萃取柱來凈化樣品提取液，經Atlantis T3色譜柱分離，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行檢測，方法操作簡便，凈化效果好，回收率高，減少雜質干擾，適用于不同種類高油脂植物源性食品中紐甜的檢測，具有普適性，提高結果準確性和穩定性，用于實際樣品的檢測，結果令人滿意，可為政府監管提供技術支撐，為復雜基質食品中紐甜的檢測提供良好的方法參考。