黃精多糖對急性心肌梗死模型大鼠心肌損傷的改善作用

安晏 李雨杺 顏曉靜

中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）13-1572-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.13.06

摘 要 目的：研究黃精多糖（PSP）對急性心肌梗死（AMI）模型大鼠心肌損傷的改善作用。方法：將大鼠按照隨機數字表法分為空白對照組、模型組、阿司匹林組（陽性對照，25 mg/kg）和PSP低、中、高劑量組（0.5、1、2 g/kg），每組10只。除空白對照組外，其余大鼠均采用結扎左冠狀動脈前降支以復制AMI模型。造模成功后，空白對照組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，給藥組大鼠灌胃相應藥物，每天1次，連續28天。末次給藥后，檢測大鼠左室射血分數（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）;觀察大鼠心肌組織病理形態學變化;采用酶聯免疫吸附試驗檢測大鼠心肌組織中氧化應激相關指標[超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、活性氧簇（ROS）]水平;采用Western blot法檢測大鼠左心室前壁組織中凋亡相關蛋白[B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（caspase-3）、caspase-8、caspase-9]和Wnt/β-聯蛋白（β-catenin）通路相關蛋白（Wnt1、β-catenin）的表達水平。結果：與模型組比較，PSP中、高劑量組和阿司匹林組大鼠LVEF、LVFS和心肌組織中SOD水平以及左心室前壁組織中Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）;心肌組織中MDA、ROS水平和左心室前壁組織中Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9、Wnt1、β-catenin蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05）;心肌組織結構紊亂和炎性細胞浸潤均減輕。結論：PSP可改善AMI模型大鼠的心肌損傷;其作用機制可能與升高心肌組織中SOD水平，降低MDA、ROS水平，調控凋亡相關蛋白和Wnt/β-catenin通路相關蛋白的表達有關。

關鍵詞 黃精多糖;急性心肌梗死;氧化應激;Wnt/β-catenin信號通路

Improvement Effects of Polygonatum sibiricum Polysaccharides on Myocardial Injury of Acute Myocardial Infarction Model Rats

AN Yan1，LI Yuxin1，YAN Xiaojing2（1. Dept. of TCM， Anyang Vocational and Technical College， Henan Anyang 455000， China; 2. Comprehensive Laboratory for Characteristic Processing Research of Menghe Clinical Prescriptions， Jiangsu Changzhou 213003， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effects of Polygonatum sibiricum polysaccharides （PSP） on the myocardial injury of acute myocardial infarction （AMI） model rats. METHODS： The rats were randomly divided into blank control group， model group， aspirin group （positive control， 25 mg/kg）， PSP low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.5， 1， 2 g/kg）， with 10 rats in each group. Except for blank control group， AMI model was established by ligation of the anterior descending branch of the left coronary artery of rats in other groups. After modeling， blank control group and model group were given normal saline intragastrically， and administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 28 days. After last medication， left ventricular ejection fraction （LVEF） and left ventricular short axis shorting rate （LVFS） of rats were detected. The morphological changes of myocardial tissue were observed. The levels of oxidative stress indexes （SOD， MDA， ROS） in myocardial tissue of rats were detected by ELISA. The expression of apoptosis-related proteins （Bcl-2， Bax， caspase-3， caspase-8， caspase-9） and the Wnt/β-catenin pathway-related proteins （Wnt1， β-catenin） in left ventricular anterior wall tissue of rats were detected by Western blot assay. RESULTS： Compared with model group， the levels of LVEF and LVFS， the levels of SOD in myocardial tissue and protein expression of Bcl-2 in left ventricular anterior wall tissue were increased significantly in PSP medium-dose， high-dose groups and aspirin group （P<0.05）; the levels of MDA and ROS in myocardial tissue， the protein expression of Bax， caspase-3， caspase-8， caspase-9， Wnt1 and β-catenin in left ventricular anterior wall tissue were decreased significantly （P<0.05）; myocardial tissue structure disorder and inflammatory cell infiltration were reduced. CONCLUSIONS： PSP can relieve myocardial injury in AMI model rats; its mechanism may be related to increasing SOD level in myocardial tissue， decreasing MDA and ROS level， regulating apoptosis-related proteins and Wnt/β-catenin pathway-related proteins.

KEYWORDS Polygonatum sibiricum polysaccharides; Acute myocardial infarction; Oxidative stress; Wnt/β-catenin pathway

急性心肌梗死（AMI）是一種常見的缺血性心臟病，是因冠狀動脈供血急劇減少或中斷導致急性缺血，從而引起嚴重而持續的心肌缺血性壞死[1-2]。近年來，組織工程和再生納米醫學等許多新方法被用于修復受損的心臟組織[3]，但是這些方法仍難以愈合由AMI所造成的心肌損傷。因此，尋找治療AMI的藥物具有重要意義。

在心肌梗死缺血的最初幾分鐘，心肌會產生強烈的氧化應激反應，進而發生心肌損傷和心肌細胞凋亡[4]。相關研究發現，Wnt/β-聯蛋白（Wnt/β-catenin）信號通路（包括Wnt1、β-catenin等19個成員）與心肌細胞凋亡、壞死和氧化應激等具有重要關系[5]。黃精是百合科植物滇黃精Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.、黃精P. sibiricum Red.或多花黃精P. cyrtonema Hua的干燥根莖，主要活性成分為黃精多糖（P. sibiricum polysaccharides，PSP）;PSP是由4種不同化學結構的單糖構成，相對分子量為8 921[6]。現代藥理研究表明，PSP具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、調血糖、調血脂、抗病毒、增強免疫力等藥理作用[7-9]。另有研究發現，PSP可改善心臟重塑模型小鼠的心功能[10]。但PSP是否可通過抗氧化、抗凋亡、調控Wnt/β-catenin通路作用來改善AMI尚不明確。

基于此，本研究以結扎左冠狀動脈前降支的方法建立大鼠AMI模型，并檢測PSP對模型大鼠氧化應激相關指標[超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和活性氧簇（ROS）]、凋亡相關因子[B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（caspase-3）、caspase-8、caspase-9]和Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白（Wnt1、β-catenin）的影響，以期為PSP的臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有BX51 型光學顯微鏡（日本Olympus 公司），XElx800型酶標儀（美國Perkin Elmer公司），RM2235型輪轉切片機、EG1160型包埋機、HI1220型烤片機（德國Leica公司），Centrifuge 5424R型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司），1659001型蛋白電泳儀、Trans-Blot SD型半干轉膜儀（美國Bio-Rad公司），GIS-500型凝膠成像儀（杭州米歐儀器有限公司），1E33型超聲心動圖檢查儀（荷蘭Philips公司），ALC-V8S型小動物呼吸機（美國Harvard Apparatus公司），ECG型小動物心電圖監測系統（美國Iworx公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有黃精多糖（純度70%）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH為6.0）（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為S27804、R20861），胰蛋白酶（美國Gibco公司，批號25200056），阿司匹林腸溶片（沈陽奧吉娜藥業有限公司，國藥準字H20065051，規格100 mg），SOD酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海西格生物有限公司，批號XG-E0829），RIPA裂解液、BCA蛋白測定試劑盒、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為P0013K、P0011、C0105），MDA ELISA試劑盒、兔源Wnt1多克隆抗體、兔源β-catenin單克隆抗體、兔源caspase-3單克隆抗體、兔源caspase-8多克隆抗體、兔源caspase-9單克隆抗體、兔源Bax單克隆抗體、兔源Bcl-2單克隆抗體、兔源GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G二抗（美國Abcam公司，批號分別為ab238573、ab15251、ab68183、ab202068、ab25901、ab202068、ab32503、ab182858、ab8245、ab6721），ECL發光液（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號34094），2，7-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號CA1410）;其余試劑為實驗室常用規格，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級SD大鼠，8周齡，雄性，體質量210～245 g，購自貴州省實驗動物工程技術中心，動物生產許可證號為SCXK（黔）2018-0001，動物使用許可證號為SYXK（黔）2018-0001。大鼠飼養于溫度為25 ℃、相對濕度為50%的環境中。所有大鼠均飼養1周后進行實驗，實驗過程嚴格遵行《實驗動物管理條例》和有關動物研究指導原則進行。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將60只大鼠按照隨機數字表法分為空白對照組、模型組、阿司匹林組（陽性對照，25 mg/kg，劑量根據文獻[11]設置）和PSP低、中、高劑量組（0.5、1、2 g/kg，劑量根據文獻[12]設置），每組10只。以1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉所有大鼠，并以仰臥位將其固定于手術臺上。手術前，先以75%乙醇對大鼠胸部進行常規消毒，再用剪刀輕輕剖開其胸部皮膚和部分肋骨（手術過程中使用小動物呼吸機將大鼠的呼吸頻率維持在100次/min，呼吸比維持在1 ∶ 2，潮氣量維持在8 mL）;當大鼠心臟顯露后，除空白對照組外，用鑷子將其余各組大鼠左冠狀動脈前降支輕輕分離并進行結扎，直到左心室前壁部分心肌組織變為白色后將手術切口進行縫合，以復制AMI模型。空白對照組大鼠除不進行結扎外，其他手術過程同造模方法操作。當大鼠心電圖Ⅱ導聯提示ST段較結扎前抬高0.2 mV，則表明心肌梗死模型造模成功[13]。造模過程中，將造模失敗或死亡的大鼠及時補齊。造模成功后，空白對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，各給藥組大鼠灌胃相應藥物（臨用時均以生理鹽水配制），灌胃體積為1 mL，每天給藥1次，連續28天。

2.2 大鼠心功能的檢測

末次給藥后24 h時，以1%戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，然后將其固定在手術臺上，采用超聲心動圖檢測其左室射血分數（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS），以評價其心臟功能。

2.3 取材和處理

在心功能檢測后，處死大鼠，取其心臟，分離左心室前壁組織和心肌組織。左心室前壁組織部分以4%多聚甲醛固定液浸泡24 h，備用;部分用于凋亡相關蛋白和Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達水平的檢測。心肌組織用于氧化應激相關指標水平的檢測。

2.4 大鼠心肌組織病理學形態觀察

取“2.3”項下以4%多聚甲醛固定的大鼠左心室前壁組織，經梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片后，以二甲苯和梯度乙醇進行脫蠟和水合;然后將上述組織置于蘇木精染色液中染色1 min，以自來水沖洗后，再置于鹽酸乙醇溶液中浸泡3 s;繼續以自來水沖洗后，將上述組織置于伊紅染色液中染色1 min，再進行脫水、封閉，然后置于顯微鏡下觀察。

2.5 大鼠心肌組織中氧化應激相關指標水平的檢測

取“2.3”項下心肌組織適量，加入PBS，于低溫條件下進行研磨，然后以12 000 r/min離心5 min，取上清液按照ELISA試劑盒說明書方法操作，采用酶標儀分別于490、695 nm波長下測定大鼠心肌組織中SOD、MDA的水平。另取“2.3”項下大鼠心肌組織適量，于無菌條件下加入PBS適量研磨，再以0.062 5%的胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液;取該單細胞懸液適量，按DCFH-DA試劑盒說明書方法操作，采用流式細胞儀檢測大鼠心肌細胞中ROS水平。

2.6 大鼠左心室前壁組織中凋亡相關蛋白和Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。取“2.3”項下大鼠左心室前壁組織適量，加入PBS適量研磨，再以0.062 5%的胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液;取該單細胞懸液以3 000 r/min離心5 min，棄上清液;取細胞沉淀加入裂解液提取總蛋白，然后采用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白經加熱變性后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉膜，以5%的脫脂牛奶封閉2 h;以TBST緩沖液清洗10 min×3次，加入GAPDH、Wnt1、β-catenin、caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax和Bcl-2的一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育過夜;以TBST緩沖液清洗10 min×3次，加入二抗（稀釋度為? 1 ∶ 2 000），孵育2 h;以TBST緩沖液清洗10 min×3次，加入ECL發光液顯色，經全自動凝膠成像系統成像。采用Image J v1.8.0軟件進行分析，以目的蛋白與內參（GAPDH）灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.7 統計學方法

采用Graphpad Prism 7.0軟件和SPSS 21.0統計軟件對數據進行分析。數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 PSP對AMI模型大鼠心功能的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠的LVEF、LVFS均顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，PSP中、高劑量組和阿司匹林組大鼠的LVEF、LVFS均顯著升高（P<0.05），詳見表1。

3.2 PSP對AMI模型大鼠心肌組織病理學形態的影響

空白對照組大鼠心肌組織結構完整，心肌纖維排列整齊、無損傷;模型組大鼠心肌結構紊亂，有大量炎性細胞浸潤等;PSP低劑量組大鼠心肌組織炎性細胞浸潤較模型組未見明顯減輕，PSP中、高劑量組和阿司匹林組大鼠心肌組織結構紊亂和炎性細胞浸潤較模型組均減輕，詳見圖1。

3.3 PSP對AMI模型大鼠心肌組織中氧化應激相關指標水平的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠心肌組織中SOD水平顯著降低，MDA、ROS水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，PSP中、高劑量組和阿司匹林組大鼠心肌組織中MDA、ROS水平均顯著降低，SOD水平均顯著升高（P<0.05），詳見表2。

3.4 PSP對AMI模型大鼠左心室前壁組織中凋亡相關蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠左心室前壁組織中Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，PSP中、高劑量組和阿司匹林組大鼠左心室前壁組織中Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），詳見圖2、表3。

3.5 PSP對AMI模型大鼠左心室前壁組織中Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠左心室前壁組織中Wnt1、β-catenin蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，PSP中、高劑量組和阿司匹林組大鼠左心室前壁組織中上述蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），詳見圖3、表4。

4 討論

AMI是一種具有高病死率、高致殘率的急性心血管疾病，其發病率逐年上升，并呈年輕化趨勢，已成為一個突出的公共衛生和社會問題[1]。目前臨床治療AMI的方法有藥物治療和冠狀動脈介入再灌注治療等，雖具有一定療效，但心肌梗死發生后的心肌壞死、心肌重構仍會導致心功能的不可逆損害[2]。

AMI的發病機制十分復雜，相關研究表明，氧化應激在AMI發生過程中具有重要作用[14];當ROS降解受損時，將會擾亂機體正常的氧化還原功能，最終導致細胞氧化損傷[15-16]。另外，ROS還能激活磷脂酶，降解膜磷脂，損傷線粒體結構，使得線粒體腫脹破裂并釋放凋亡相關物質進入細胞質[17]。研究表明，SOD可以中和組織產生的自由基，其過度消耗也是引起氧化應激損傷的重要原因[18]。MDA是脂質過氧化物終產物，與ROS水平呈正相關關系，是評估氧化應激損傷的敏感指標[19]。本研究發現，經PSP干預后，AMI模型大鼠心肌組織中MDA、ROS水平均顯著降低，SOD水平顯著升高，心功能指標LVEF、LVFS均顯著升高，表明PSP可通過抗氧化作用，改善AMI所致大鼠心肌損傷。

AMI發生后，梗死部位的心肌細胞在缺氧、能量代謝異常等因素的影響下，可激活誘導細胞凋亡的信號通路[20]。研究表明，Bcl-2家族在細胞凋亡過程中具有重要作用，其主要成員有Bax和Bcl-2，其中Bcl-2發揮抑制凋亡的作用，而Bax則可通過拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用減少細胞凋亡的發生[21]。研究證實，caspase家族是細胞凋亡過程中的重要執行者，參與調節了大部分細胞凋亡通路，該家族成員眾多：caspase-8和caspase-9是凋亡啟動子，位于信號通路的上游部分;caspase-3是凋亡的效應因子，當其被啟動因子激活后，可誘導凋亡的發生[22]。本研究發現，經PSP干預后，AMI模型大鼠左心室前壁組織中Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白表達水平均顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高，表明PSP可通過抑制心肌細胞凋亡，改善AMI所致大鼠心肌損傷。

在正常心肌組織中，Wnt/β-catenin信號通路處于失活狀態;而在發生心肌缺血和心肌梗死的心肌組織中，該通路呈過度活化狀態，且其活化后可誘導心肌細胞凋亡、促進心室重塑[5]。張韓等[23]研究發現，與正常心肌細胞比較，在缺氧復氧心肌細胞中Wnt1、β-catenin蛋白表達水平均顯著升高，心肌細胞的凋亡水平也顯著增強。還有研究發現，可通過Wnt/β-catenin通路調控大鼠心肌梗死后的心肌細胞凋亡[24]。本研究發現，經PSP干預后，AMI模型大鼠左心室前壁組織中Wnt1、β-catenin蛋白表達水平均顯著降低，表明PSP可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達，改善AMI所致大鼠心肌損傷。

綜上所述，PSP可改善AMI模型大鼠的心肌損傷;其作用機制可與升高心肌組織中SOD水平，降低MDA、ROS水平，調控凋亡相關蛋白和Wnt/β-catenin通路相關蛋白的表達有關。

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（收稿日期：2021-03-05 修回日期：2021-04-12）

（編輯：唐曉蓮）