高鹽誘導下以 TonEBP/NF-κB 通路為基礎的小鼠巨噬細胞表型偏移機制的研究

朱 哲，楊國紅，趙季紅

長期過量的食鹽攝入，不僅會增加患高血壓的風險，還可對相關靶器官造成損害。多項研究表明，鹽敏感性高血壓等心血管疾病的發生、發展及其靶器官損害的病理過程與巨噬細胞表型偏移密切相關。基于當前對巨噬細胞的研究，通常將其分為M1型和M2型兩種亞型。本課題組前期研究發現，高鹽喂養下小鼠巨噬細胞表型向M1型偏移可加重機體炎性反應，升高血壓并促進小鼠左心室重塑。在后續的細胞實驗中本課題組發現高鹽刺激下小鼠巨噬細胞向M1型發生偏移的同時伴隨張力應答增強子結合蛋白(tonicity-responsiveelement binding protein，TonEBP)與核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的表達增強，且二者表達水平呈正相關。TonEBP可在高滲條件下被激活，參與維持哺乳動物細胞內滲透壓力的平衡。位于TonEBP下游的NF-κB是細胞內重要的核轉錄因子，廣泛參與機體各類炎性反應。對于高鹽刺激下巨噬細胞表型偏移是否和TonEBP/NF-κB信號通路激活有關，通過調節此通路是否可以干預巨噬細胞表型偏移方向的研究還未有報道。本研究通過探討高鹽刺激下巨噬細胞表型偏移的可能機制，為進一步研究巨噬細胞相關心血管疾病的防治提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 一般材料 Raw264.7細胞(小鼠巨噬細胞)由武警特色醫學中心實驗室提供。TonEBP基因沉默慢病毒載體設計構建與包裝服務由上海合生基因生物公司提供；氯化鈉購自天津風船化學試劑科技公司；胎牛血清(FBS)、高糖培養液(DMEM)購自美國Gibco公司;引物設計合成由北京六合華大基因科技有限公司提供；RIPA組織/細胞快速裂解液(RIPA buffer high)、嘌呤霉素(Puromycin)、Tween 20均購自北京索萊寶科技公司；GAPDH抗體、p-IKKα/β抗體、p-NF-κB抗體購自美國Affinity公司；SYBRGreen實時定量PCR試劑、5X All-IN-One RT MasterMix、NF-κB 抗體、TonEBP抗體購自美國Abcam公司；BCA 法蛋白定量試劑盒購自江蘇碧云天公司。

1.2方法

1.2.1 細胞培養 將細胞置于10%FBS的高糖培養液中，37℃培養于5%CO2無菌條件下，待細胞長至對數生長期，選取合適量的細胞進行實驗。

1.2.2 慢病毒感染和篩選 針對小鼠TonEBP基因設計3種針對不同干擾位點的綠色熒光慢病毒干擾載體和1種綠色熒光慢病毒空載載體pHS-ASR-LW198，載體信息見表1。將Raw264.7細胞以5×105/孔接種于24孔板，待細胞融合至約50%密度大更換培養液，依據每種慢病毒滴度及預先確定的MOI值，加入適量慢病毒后繼續培養(空白對照組細胞不加入慢病毒)。后以嘌呤霉素篩選培養液連續篩選至空白對照組細胞90%以上死亡后，停止篩選，獲得三組穩定干擾TonEBP的慢病毒感染細胞及一組陰性對照慢病毒空載細胞。之后將各組細胞擴大培養，穩定傳代。傳代3次后，提取各組細胞RNA，利用Real-time PCR檢測各組細胞TonEBP 基因相對表達量，選取干擾效率最高的慢病毒感染細胞株命名為TonEBP-shRNA，野生型Raw264.7細胞株命名為Control。

表1 shRNA慢病毒靶序列

1.2.3 實驗分組及干預方式 為檢測高鹽刺激下TonEBP/NF-κB對巨噬細胞表型的調控作用，設置分組，分為對照(Control)組，高鹽(HS，40 mmol/L Nacl)組，高鹽+TonEBP-shRNA(HS+TonEBP-shRNA)組，高鹽+吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC, pyrrolidinedithioearbamate，NF-κB抑制劑，HS+PDTC)組。分別將各組細胞以合適數量接種于6孔板中，待細胞貼壁后，棄去HS組、HS+TonEBP-shRNA組和HS+PDTC組培養液，給予高鹽培養液進行干預。HS+PDTC組在給予高鹽培養液干預前2 h加入配置好的PDTC溶液，2 h后與HS組、HS+TonEBP-shRNA組同步更換高鹽培養液。高鹽干預24 h后收集各組細胞進行相關實驗。

1.2.4 Real-time PCR檢測各組M1、M2型巨噬細胞表型標志物基因表達情況 分組培養24 h后取各組細胞1×106個，分別接種于10 cm培養皿中。培養24 h后收取各組細胞，利用Trizol法提取各組細胞RNA，測定各組RNA的純度及濃度后進行反轉錄，合成cDNA，以合適倍數稀釋cDNA后采用Real-time PCR法檢測mRNA的表達量。設置復孔，以GAPDH為內參，目的基因相對表達量由2-ΔΔCt計算得出(ΔΔCt=實驗組ΔCt-內參組ΔCt)。

1.2.5 Western blot法檢測各組TonEBP、pIKKα/β、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達水平 取各組對數生長期細胞2×106個，離心后留取沉淀。加入配制好的細胞裂解液吹打混勻后于冰上裂解30 min，離心后收集蛋白上清液。配制標準BCA液，按其濃度梯度，每孔加入BCA液100 μl，5 μl蛋白上清液。避光孵育30 min后上機檢測蛋白濃度。以Loading Buffer稀釋蛋白上清液，之后于100℃恒溫器中煮沸7 min，完成蛋白變性。取蛋白樣本于SDS-PAGE分離等量蛋白后進行轉膜。轉膜結束后將PVDF膜放入TBST中清洗5 min后以5%BSA溶液于搖床上室溫封閉1 h。洗膜3次，添加一抗，4℃孵育過夜。洗膜3次，加入二抗工作液，室溫條件下孵育1 h,洗膜后置于凝膠成像儀中進行顯影，觀察各組蛋白表達情況。

2 結 果

2.1 穩定干擾TonEBP細胞株的建立 利用慢病毒成功感染細胞后經篩選得到4組穩定株。測定各組穩定細胞株中TonEBP mRNA相對表達量，結果與對照組細胞相比，編號pHS-ASR-LW222的病毒株干擾效率達70%以上，差異有統計學意義(P<0.01)，明顯高于其他組，而空載慢病毒感染組干擾效率與對照組相比，差異無統計學意義(圖1)。

圖1 Real-time PCR檢測各組細胞TonEBP mRNA表達水平

2.2 高鹽刺激下各組M1、M2型巨噬細胞表型標志物基因mRAN表達情況 本部分實驗為驗證高鹽刺激下巨噬細胞TonEBP/NF-κB通路的激活可影響其表型偏移方向，我們檢測了各組細胞TonEBP、NF-κB、M1型巨噬細胞表型標志物TNF-α、CCL5、INOS和M2型巨噬細胞表型標志物MRC-1、FIZZ1、IL-10的mRNA相對表達量。結果顯示：(1)較Control組，HS組TonEBP、NF-κB和M1型巨噬細胞表型標志物的mRNA水平均明顯升高(P<0.05)，M2型巨噬細胞表型標志物的mRNA水平均明顯降低(P<0.05);(2)與HS組比較，HS+ TonEBP-shRNA組、HS+PDTC組的TonEBP、NF-KB表達水平均明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，M1型巨噬細胞表型標志物mRNA表達水平均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，M2型巨噬細胞表型標志物mRNA水平均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。以上結果提示高鹽刺激可促使小鼠巨噬細胞向M1型方向偏移，通過干擾TonEBP和NF-κB的表達可使巨噬細胞向M2型方向偏移，M1型巨噬細胞比例減少(表2)。

表2 各組細胞 TonEBP、NF-κB及表型標志物mRNA水平

2.3 各組TonEBP、p-IKKα/β、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達水平 Western blot結果顯示：(1)HS組TonEBP、NF-κB、p-NF-κB、p-IKKα/β及NF-κB磷酸化比例較Control組明顯增加(P<0.05)；(2)與HS組比較，HS+TonEBP-shRNA組TonEBP蛋白表達水平明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，HS+PDTC組TonEBP蛋白表達水平略有增加，但差異無統計學意義；HS+TonEBP-shRNA組和HS+PDTC組的NF-κB、p-IKKα/β、p-NF-κB蛋白表達水平均明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)，NF-κB磷酸化比例略有下降，但差異無統計學意義。Western blot對蛋白的檢測結果與mRNA的變化趨勢基本一致，提示高鹽刺激下TonEBP/NF-κB通路被激活，通過下調TonEBP的表達可有效抑制NF-κB的活化(圖2、表3 )。

圖2 Westem blot檢測TonEBP-NF-κB信號轉導通路在高鹽干預下的蛋白表達情況

表3 各組細胞相關蛋白表達水平

3 討 論

目前，心血管疾病已成為世界最重要的公共衛生問題之一，最新數據表明，它是導致死亡和生活質量下降的主要原因[1]。有學者認為，長期高鈉飲食下機體組織鈉濃度超過限度會引起機體一系列炎性反應，激活機體免疫系統，最終導致以免疫系統失衡為特征的炎性狀態，這也是高血壓等心血管疾病的患病率近年顯著上升的一個重要原因[2]。巨噬細胞作為免疫系統的主要功能細胞，其亞型比例失衡被證明與動脈粥樣硬化、鹽敏感性高血壓等心血管疾病的發病及其靶器官損害密切相關[3]。研究表明，M1型巨噬細胞可以產生大量的促炎因子誘導炎性發生引發組織損傷，因此也被稱為"促炎型"巨噬細胞。M2型巨噬細胞則可以抑制炎性反應，修復組織損傷，因此也被稱為“抗炎型”巨噬細胞[4,5]。多項體內外實驗發現，高鹽刺激可促使巨噬細胞向M1型發生偏移，同時抑制M2型巨噬細胞的活化[6,7]。研究顯示在伴隨高血壓發生的心、腦、腎等相關靶器官的損害過程中可見巨噬細胞在組織器官中大量浸潤，且靶器官功能惡化程度與巨噬細胞亞型比例及浸潤程度密切相關[8]。本課題組前期研究發現，高鹽喂養下小鼠體內M1型巨噬細胞比例增加，M2型巨噬細胞比例下降，這一改變可加重小鼠體內的炎性反應、血壓升高并促進左心室重塑的進程。

有研究表明，在正常組織中，信號傳導及轉錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)參與M1/ M2型巨噬細胞的比例的調節，由STATs介導的巨噬細胞表型偏移過程與IL-4、IL-13、IL-10及NF-κB等炎性因子的激活或抑制密切相關[9]，提示我們適當的炎性刺激或是巨噬細胞表型偏移的重要推力。然而當前有關高鹽刺激下巨噬細胞表型偏移機制的研究卻少有報道。本課題組前期細胞實驗發現，高鹽刺激下小鼠巨噬細胞中TonEBP 和NF-κB的表達明顯升高，且兩者表達量呈正相關(數據未發表)。TonEBP是細胞內廣泛表達的轉錄因子，其不僅具有高滲環境下維持細胞穩態的功能，還可在一些炎性反應中發揮作用。多項研究表明TonEBP、NF-κB在巨噬細胞的極化過程中發揮十分重要的作用[10,11]，由此我們推測，高鹽刺激下TonEBP/NF-κB通路的激活是導致巨噬細胞表型偏移的機制之一。

本研究以小鼠巨噬細胞為研究對象，通過慢病毒感染技術敲低細胞TonEBP的表達，留取TonEBP-shRNA穩定干擾細胞株。經測定后篩選，慢病毒感染細胞TonEBP mRNA的干擾效率達70%以上，說明感染成功可用作后續實驗。因巨噬細胞活化后可釋放大量炎性因子，如M1型巨噬細胞可釋放促炎型細胞因子TNF-α、iNOS、CCL5等，M2型巨噬細胞可釋放抗炎型細胞因子IL-10、MRC1、FIZZ1等[12,13]，所以我們選定以上因子分別作為M1、M2型巨噬細胞的表型標志物，檢測各實驗組以上基因及TonEBP、NF-κB的mRNA相對表達量通過與對照組比較來判定Raw264.7細胞偏移方向。結果顯示單純高鹽刺激下TonEBP/NF-κB信號通路被激活，此條通路激活后可誘導小鼠巨噬細胞向M1型極化。進一步干擾TonEBP/NF-κB信號通路可一定程度上改變高鹽刺激下巨噬細胞表型偏移方向。

為了進一步證實高鹽刺激對TonEBP/NF-κB信號通路的激活作用，我們檢測了此信號通路上相關蛋白表達水平。在大多數細胞中，NF-κB存在于胞漿中，與抑制性蛋白IK-β結合時處于無活性狀態，在受到有效刺激后IK-β激酶IKK被激活發生磷酸化，構象發生改變，NF-κB脫落活化為p-NF-κB進入胞核參與有關基因的轉錄[14]。因此我們選定TonEBP、p-IKKα/β、NF-κB、p-NF-κB作為目標蛋白，采用Western blot法測定各組蛋白表達水平及p-NF-κB/ NF-κB比值，進一步評估高鹽干預下TonEBP/NF-κB信號通路的激活情況。結果提示高鹽刺激下TonEBP/NF-κB信號通路被激活，通過下調TonEBP的表達可有效抑制NF-κB的活化。有學者研究發現，在小鼠巨噬細胞中，TonEBP可通過增強NF-κB的活性來保護細胞免受高鹽刺激的影響[15]，說明由高鹽造成的高滲環境對NF-κB活性的刺激作用一定程度上取決于TonEBP活性。且有多項研究表明，NF-κB的活化是促使巨噬細胞向M1型發生極化的重要因素[16,17]。結合本研究及以上研究成果，進一步佐證了高鹽刺激下巨噬細胞中TonEBP /NF-κB信號通路的激活是促使其向M1型巨噬細胞發生偏移的重要機制。

本研究結果表明，高鹽刺激下TonEBP/NF-κB信號通路的激活是巨噬細胞向M1型方向偏移的可能機制，這一發現為高鹽刺激下相關心血管疾病的發病機制提供了實驗依據。然而包括鹽敏感性高血壓在內的相關心血管疾病的發病及發展是涉及全身多個系統的慢性炎性過程，體外實驗或不能全面說明問題，還需要在體實驗的支持和佐證。同時，不同亞型巨噬細胞功能特性、其局部浸潤程度及分泌的細胞因子或是影響機體血壓及靶器官損害程度的重要因素，有待進一步研究。