α7煙堿樣乙酰膽堿受體激動(dòng)劑后處理對(duì)高膽固醇血癥大鼠在體心肌缺血/再灌注損傷的影響

溫 超，薛富善，王玉慧，金錦花

雖然藥物溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等是臨床治療包括急性心肌梗死在內(nèi)的缺血性心臟病的主要手段，但由此所致的心肌缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury, IRI)則是影響患者康復(fù)和預(yù)后的重要因素[1]。研究證實(shí)，在正常動(dòng)物應(yīng)用高選擇性α7nAChR激動(dòng)劑PNU282987，可對(duì)心肌IRI產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用[2]。眾所周知，高膽固醇血癥是缺血性心臟病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，能明顯影響多種干預(yù)措施對(duì)心肌IRI的保護(hù)作用[3]。高膽固醇血癥存在情況下，α7nAChR激動(dòng)劑后處理是否仍具有心肌保護(hù)作用？本實(shí)驗(yàn)擬評(píng)價(jià)α7nAChR激動(dòng)劑后處理對(duì)高膽固醇血癥大鼠在體心肌IRI影響，旨在為臨床防治及相關(guān)藥物開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇及分組 SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，體質(zhì)量130～150 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝取飼料和飲用酸化自來(lái)水；飼養(yǎng)室內(nèi)保持安靜，溫度23～25 ℃，濕度55%～75%，12 h照明/12 h黑暗。將30只大鼠隨機(jī)分為高膽固醇血癥組和正常對(duì)照組，各15只。

1.2 高膽固醇血癥大鼠模型的建立 參照文獻(xiàn)[4，5]的方法，給大鼠喂養(yǎng)高膽固醇飼料(含2%膽固醇和0.5%膽鹽)8周，采用美國(guó)貝克曼自動(dòng)生化儀AU480測(cè)量大鼠血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)濃度。正常對(duì)照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)8周。

1.3 心肌IRI模型的建立 參照既往文獻(xiàn)[6，7]的方法，建立在體心肌IRI模型。術(shù)前大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，氣管切開(kāi)連接小動(dòng)物呼吸機(jī)(HX-101E，成都泰盟軟件有限公司)進(jìn)行機(jī)械通氣，潮氣量2～3 ml/100 g，通氣頻率60～80次/min。顯露右頸總動(dòng)脈并置管，連接BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)持續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓。于右前肢、右后肢和左后肢皮下置入電極，監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。顯露右頸內(nèi)靜脈，置管后肝素封管，以備靜脈給藥。通過(guò)第4肋間開(kāi)胸顯露心臟，去除部分心包膜，在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間，距離左心耳尖端2 mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(left anterior descending artery，LAD)，以結(jié)扎線遠(yuǎn)端心外膜發(fā)紺或發(fā)白，ECG示ST段抬高為L(zhǎng)AD阻斷成功，30min后松開(kāi)結(jié)扎線，缺血區(qū)心外膜顏色恢復(fù)紅潤(rùn)，抬高ST段降低幅度大于50%為心肌IRI模型建立成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)方案 采用隨機(jī)數(shù)字表法，將15只高膽固醇血癥大鼠和15只正常大鼠均隨機(jī)分為3組(每組5只)：高膽固醇血癥大鼠對(duì)照組(hypercholesterolemic rats in control group, HC)和正常大鼠對(duì)照組(normal rats in control group, NC)、高膽固醇血癥大鼠缺血/再灌注損傷組(hypercholesterolemic rats in IRI group, HI)和正常大鼠缺血/再灌注損傷組(normal rats in IRI group, NI)、高膽固醇血癥大鼠PNU282987后處理組(hypercholesterolemic rats in PNU282987 postconditioning group, HPNU)和正常大鼠PNU282987后處理組(normal rats in PNU282987 postconditioning group, NPNU)。

HC組和NC組，在LAD下方穿線但不結(jié)扎，觀察30 min時(shí)經(jīng)右頸內(nèi)靜脈注射生理鹽水1 ml，繼續(xù)觀察120 min；HI組和NI組， LAD 阻斷30 min，再灌注前即刻經(jīng)右頸內(nèi)靜脈注射生理鹽水1ml，再灌注120 min； HPNU組和NPNU組：LAD阻斷30 min，再灌注前即刻經(jīng)右頸內(nèi)靜脈注射PNU282987(2.0 mg/kg，總?cè)萘繛? ml)，然后再灌注120 min。

再灌注120 min時(shí)，全部動(dòng)物經(jīng)右頸總動(dòng)脈取血3 ml，靜置30 min，4 ℃離心，收集上清液，凍存于-80 ℃冰箱中待測(cè)。使用美國(guó)貝克曼自動(dòng)生化儀AU480，氧化酶法檢測(cè)血清TC和TG濃度，直接法檢測(cè)血清LDL濃度，免疫抑制法檢測(cè)血清肌酸激酶同工酶MB(Creatine kinase isoenzyme，CK-MB)濃度，速率法檢測(cè)肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ，cTnⅠ)濃度，ELISA法檢測(cè)血清腫瘤壞死因子α(Tumour Necrosis Factor alpha，TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(Interleukin 6，IL-6)濃度。

1.5 心肌梗死面積測(cè)定 再灌注120 min時(shí)，再次結(jié)扎LAD，經(jīng)右頸內(nèi)動(dòng)脈注射2%伊文氏藍(lán)溶液1.5 ml，待大鼠口唇和遠(yuǎn)端肢體皮膚藍(lán)染后，經(jīng)右頸內(nèi)靜脈注射10%氯化鉀處死大鼠，用4 ℃磷酸鹽緩沖液洗去表面和心室內(nèi)殘血，沿冠狀溝切除左心房、右心房和右心室。放入-20 ℃冰箱冷凍30 min，于LAD結(jié)扎水平向心尖方向垂直于左心室縱軸將左心室均勻切成5片，在切片橫截面上被藍(lán)染的區(qū)域?yàn)榉侨毖獏^(qū)，未被藍(lán)染的區(qū)域?yàn)樾募∪毖ｋU(xiǎn)區(qū)(AAR)。將心臟切片放入2 ml含1%氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC)溶液中，37 ℃避光水浴震蕩5～10 min，再置于4%中性甲醛(4 ℃)溶液中固定過(guò)夜，存活心肌呈磚紅色，梗死心肌呈灰白色。將每張心臟切片照相，采用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics, Inc, Rockville，美國(guó))圖像處理軟件進(jìn)行分析。將心肌梗死區(qū)的百分比數(shù)值除以缺血危險(xiǎn)區(qū)的百分比數(shù)值，即為心肌梗死面積(Infarct size，IS%)。

2 結(jié) 果

2.1 血脂水平對(duì)比 與NC組相比(1.90±0.32，0.32±0.05)，HC組血清TC和LDL水平(3.99±0.47，0.90±0.13)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 血清心肌酶水平對(duì)比 在正常大鼠，與NC組相比，NI組和NPNU組血清CK-MB和cTnI水平明顯升高(P<0.05)；與NI組相比，NPNU組血清CK-MB和cTnI水平明顯降低(P<0.05)。在高膽固醇血癥大鼠，與HC組相比，HI組 和HPNU組血清CK-MB和cTnI水平明顯升高(P<0.05)。組間比較，與NI組相比，HI組血清CKMB及cTnI水平明顯升高(P<0.05)；與NPNU組相比，HPNU組血清CKMB及cTnI水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 正常和高膽固醇血癥大鼠血清cTnI和CK-MB水平比較

2.3 血清IL-6和TNF-α水平 在正常大鼠，與NC組相比，NI組和NPNU組血清TNF-α和IL-6水平明顯升高(P<0.05)；與NI組相比，NPNU組血清IL-6和TNF-α水平明顯降低(P<0.05)。在高膽固醇血癥大鼠，與HC組相比，HI組和HPNU組血清TNF-α和IL-6水平明顯升高(P<0.05)。組間比較，與NI組相比，HI組血清IL-6及TNF-α水平明顯升高(P<0.05)；與NPNU組相比，HPNU組血清IL-6及TNF-α水平明顯升高(P<0.05，表2)。

表2 正常和高膽固醇血癥大鼠血清IL-6和TNF-α水平的比較 (n=5；pg/ml)

2.4 心肌梗死面積 HC組和NC組均未接受心肌IRI干預(yù)，未觀察到心肌梗死。與NI組(51.74±3.47)相比，NPNU組(39.50±3.00)心肌梗死面積明顯縮小(P<0.05)，HI(64.34±3.40)和HPNU組(62.20±4.90)心肌梗死面積明顯增加(P<0.05)。與NPNU組相比， HI和HPNU組心肌梗死面積明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)研究[8-11]中，常用兔、鶴鶉、小鼠、大鼠、金黃地鼠等動(dòng)物建立高膽固醇血癥模型。由于大鼠心臟血管解剖和分布與人類(lèi)極為相似，是研究心肌IRI發(fā)生機(jī)制及其保護(hù)措施較理想的動(dòng)物模型[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，將1月齡的SD大鼠采用高膽固醇飼料喂養(yǎng)8周后，血清TC和LDL水平明顯升高，表明高膽固醇血癥模型建立成功,與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致。

血清CK-MB和cTnI水平是IRI實(shí)驗(yàn)研究中評(píng)價(jià)心肌損傷的常用生物學(xué)指標(biāo)[14，15]。本研究結(jié)果顯示，正常和高膽固醇血癥大鼠發(fā)生心肌IRI后，血清CK-MB和cTnI水平明顯升高。而且與正常大鼠相比，高膽固醇血癥大鼠心肌IRI后血清CK-MB和cTnI水平升高更為明顯(P<0.05)，提示高膽固醇血癥可加重心肌IRI。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在正常大鼠，PNU282987后處理能明顯降低血清CK-MB和cTnI濃度，這與既往研究結(jié)果一致[16]。但是對(duì)于高膽固醇血癥大鼠， PNU282987后處理組的血清CK-MB和cTnI水平與HI組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

心肌梗死面積是評(píng)價(jià)心肌損傷和干預(yù)措施心肌保護(hù)作用的金標(biāo)準(zhǔn)，而且伊文氏藍(lán)-TTC雙染色測(cè)定梗死面積已被廣泛用于心肌IRI的實(shí)驗(yàn)研究[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠， PNU282987后處理使IRI后的心肌梗死面積減少23.7%，提示PNU282987后處理均具有良好的心肌保護(hù)作用，這與既往研究結(jié)果相一致[16]。但是高膽固醇血癥大鼠PNU282987后處理后的心肌梗死面積無(wú)明顯改變，表明高膽固醇血癥時(shí)PNU282987后處理的心肌保護(hù)作用消失，這也與心肌損傷的生物學(xué)參數(shù)改變相一致。

現(xiàn)有證據(jù)表明，IRI是多種因素相互作用的結(jié)果，其中炎性反應(yīng)是最重要的致病因素之一[18]，而IL-6和TNF-α在心肌IRI的炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，是研究心肌IRI炎性反應(yīng)時(shí)最常選用的兩個(gè)指標(biāo)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠，PNU282987后處理均可明顯降低血清IL-6和TNF-α水平，提示PNU282987后處理心肌保護(hù)作用可能與炎性反應(yīng)抑制有關(guān)。再者，HPNU組血清IL-6及TNF-α水平與HI組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明PNU282987后處理對(duì)高膽固醇血癥大鼠心肌IRI過(guò)程中的炎癥反應(yīng)無(wú)抑制作用。綜合這些結(jié)果提示，高膽固醇血癥能明顯影響干預(yù)措施對(duì)心肌IRI過(guò)程中炎性反應(yīng)的抑制作用，尤其是PNU282987后處理。

通常認(rèn)為，后處理治療IRI最具臨床應(yīng)用價(jià)值，尤其是藥物后處理[20]。本研究采用貼合臨床實(shí)際的高膽固醇血癥心肌缺血/再灌注損傷模型作為研究對(duì)象，通過(guò)評(píng)價(jià)高膽固醇血癥對(duì)α7nAChR激動(dòng)劑后處理心肌保護(hù)作用的影響，為獲得臨床可行的心肌保護(hù)策略提供了思路和參考。

綜上所述，高膽固醇血癥可加重心肌IRI并完全消除α7nAChR激動(dòng)劑后處理的心肌保護(hù)作用。炎性反應(yīng)增強(qiáng)參與了高膽固醇血癥影響α7nAChR激動(dòng)劑后處理心肌保護(hù)作用的過(guò)程，可能是改善高膽固醇血癥時(shí)心肌保護(hù)干預(yù)措施效應(yīng)的靶點(diǎn)。