光動力療法對黑色素瘤細胞遷移、侵襲的影響及作用機制△

張召力，李淑香

廈門市第五醫院1皮膚科，2血透室，福建 廈門 361101

黑色素瘤是黑色素細胞惡變形成的，多見于皮膚，偶見于眼睛、鼻腔等部位，黑色素瘤起病初期可通過外科手術治療方式將其切除，但若干預、治療不及時，黑色素瘤細胞將會發生遷移和侵襲，依靠現有的醫療手段，治療效果往往難以達到預期，生存率普遍不高。因此，抑制黑色素瘤的遷移和侵襲是提高黑色素瘤患者生存率的關鍵。光動力療法屬于微創療法，臨床常將其應用于非黑色素性皮膚癌的治療中，且均取得了理想的治療效果。有報道顯示，光動力療法可通過抑制核因子κB 信號通路達到促進腫瘤細胞凋亡的目的，繼而抑制細胞惡變。然而經查閱文獻發現，有關光動力療法治療黑色素瘤的研究并不多見，且研究結論尚未統一。鑒于此，本研究探討了光動力療法對黑色素瘤細胞遷移、侵襲的影響及作用機制，旨在為黑色素瘤患者的治療開辟新的思路，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

溶媒：滅菌注射用水、生理鹽水。腫瘤細胞株：黑色素瘤細胞株B16-F10購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心；羊胚素：每瓶25 mg。二甲基亞砜、胰蛋白酶、培養基與胎牛血清均購自美國Sigma公司，二喹啉甲酸試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；破膜液購自武漢博士德生物工程有限公司，流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；Ki-67抗體、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）抗體均購自英國Abcam 公司。研究涉及的所有材料均在有效期內，且儀器的使用均由專業人員在嚴格質控下完成。

1.2 黑色素瘤細胞B16-F10 的培養

復蘇黑色素瘤細胞B16-F10，將其置于含有10%胎牛血清與青霉素的高糖培養基中，在5%CO、37 ℃培養箱中培養，當細胞生長至融合度約為90%時進行傳代，每3 天傳代一次，傳代時使用0.25%胰蛋白酶細胞消化液進行處理。

1.3 細胞劃痕實驗檢測黑色素瘤細胞B16-F10 的遷移能力

選取生長至對數期的黑色素瘤細胞B16-F10，經胰蛋白酶消化處理后接種在六孔板內，并在每個孔中加入2 ml 細胞懸液繼續培養1 天。當細胞融合度≥80%時，孵育光敏劑，給予1 mmol/L 5-氨基酮戊酸，2 h 后給予635 nm 紅光照射治療，能量分別為0 J（A 組）、2.4 J（B 組）、4.8 J（C 組），以未進行紅光照射的細胞作為對照組。然后采用1 ml 移液槍槍頭垂直于培養板劃“一”字劃痕，之后加入胎牛血清，再次放入培養箱，光動力療法的時間為24 h，通過顯微鏡下拍攝的照片觀察并比較細胞遷移情況。采用Image J 定量評估劃痕愈合率，劃痕愈合率=（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積）/24 h 劃痕面積×100%。對照組不給予任何干預。

1.4 Transwell 實驗檢測黑色素瘤細胞B16-F10 的侵襲能力

將預先在Transwell 上室內平鋪好的Matrigel膠放在37 ℃培養箱中聚合2 h，與遷移能力檢測方法相同，進行孔內培養、孵育、光照，制成單細胞懸液后，將其培養在含有1%胎牛血清的培養基中，并調整細胞密度為1×10/ml，在Transwell 下室中加入培養基（含胎牛血清），并在下室中鋪入制好的細胞懸液，恒溫（37 ℃）培養1 天，然后采用0.5%結晶紫對上室底部的細胞染色，顯微鏡下觀察并記錄細胞數量。

1.5 蛋白質印跡法（Western blot）檢測遷移和侵襲相關蛋白的相對表達量

采用RIPA 裂解液提取各組細胞中的蛋白，并采用二喹啉甲酸試劑盒檢測蛋白濃度，各組分別選取40 μg 蛋白，采用10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，采用半干法將分離后的目標蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，應用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后加入適宜濃度的一抗（Ki-67 抗體的稀釋比例為1∶100，VEGF 抗體的稀釋比例為1∶1000，MMP9 抗體的稀釋比例為1∶800），4 ℃孵育過夜，次日取出PVDF 膜，洗去膜上未結合的一抗，加入二抗37 ℃孵育1 h 后，滴加化學發光顯色液進行曝光顯影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參，計算Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相對表達量。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 光動力療法對黑色素瘤細胞B16-F10 遷移、侵襲的影響

細胞劃痕實驗和Transwell 實驗結果顯示，對照組、A 組、B 組、C 組的劃痕愈合率和侵襲細胞數目比較，差異均有統計學意義（

P

﹤0.01）。A 組、B組、C 組的劃痕愈合率和侵襲細胞數目均低于對照組，B 組、C 組的劃痕愈合率和侵襲細胞數目均低于A 組，C 組的劃痕愈合率和侵襲細胞數目均低于B 組，差異均有統計學意義（

P

﹤0.05）。（表1）

表1 不同組別黑色素瘤細胞B16-F10 劃痕愈合率和侵襲細胞數目的比較（±s）

2.2 光動力療法對黑色素瘤細胞B16-F10 中遷移和侵襲相關蛋白相對表達量的影響

對照組、A 組、B 組、C 組黑色素瘤細胞B16-F10 中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相對表達量比較，差異均有統計學意義（

P

﹤0.01）。A 組、B 組、C組中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相對表達量均低于對照組，B 組、C 組中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相對表達量均低于A 組，C 組中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相對表達量均低于B 組，差異均有統計學意義（

P

﹤0.05）。（表2）

表2 不同組別黑色素瘤細胞B16-F10中遷移和侵襲相關蛋白相對表達量的比較（±s）

3 討論

研究顯示，絕大多數皮膚癌患者死亡的直接原因為黑色素瘤，盡管黑色素瘤僅占皮膚癌的5%左右，且早期黑色素瘤患者可通過外科手術治療，但術后復發率高一直是臨床尚未攻克的難題，進展期黑色素瘤患者的預后更不理想，病死率居高不下，其根本原因在于細胞增殖與凋亡受到抑制，因此治療黑色素瘤的根本在于抑制黑色素瘤細胞的異常增殖或促進黑色素瘤細胞凋亡。

光動力療法是近年來新興的腫瘤治療方法，其原理如下：使局部細胞攝取光敏劑并視情況給予光照射，在氧分子與光敏劑的協同作用下，發生氧化損傷，造成靶細胞壞死、凋亡，誘發炎癥免疫反應。光動力療法在發揮促進腫瘤細胞凋亡作用的同時，對正常的組織細胞幾乎不會造成影響，因此臨床對皮膚癌、食管癌等惡性腫瘤的治療時均會開展光動力療法。眾所周知，遷移和侵襲是腫瘤病灶重要的惡性生物學特征之一，這一過程尤為繁雜，包括原發性腫瘤血管產生，腫瘤細胞脫落后侵襲鄰近組織的基底膜、細胞外基質，通過全身循環轉移至其他部位進行生長。其中腫瘤血管生成是促進腫瘤細胞增殖與轉移的關鍵，VEGF 是促血管生成因子，當其與受體結合后，可使內皮細胞增殖與分泌增多，大量細胞基質被降解，加速血管腔形成的同時促進細胞增殖、侵襲。Ki-67 是一種與細胞增殖密切相關的抗原，Ki-67 的表達水平可直接反映細胞的增殖活性，因此臨床常將其作為黑色素瘤患者預后的評估指標之一。研究表明，MMP9 在腫瘤遷移和侵襲的過程中至關重要，其主要的生物學作用是降解細胞外基質，當機體內基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）與金屬蛋白酶組織抑制劑之間的平衡被打破時，細胞外基質的異常代謝產物將是腫瘤細胞轉移的重要促進因子。本研究結果顯示，對照組、A 組、B 組、C 組的劃痕愈合率和侵襲細胞數目比較，差異均有統計學意義（

P

﹤0.01），其中C 組的劃痕愈合率和侵襲細胞數目均最低，然后由低至高依次為B 組、A 組、對照組，表明光動力療法可抑制黑色素瘤細胞的遷移和侵襲能力。此外，本研究結果還顯示，對照組、A 組、B 組、C 組黑色素瘤細胞B16-F10 中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相對表達量比較，差異均有統計學意義（

P

﹤0.01），其中C 組中Ki-67、VEGF、MMP9 蛋白的相對表達量均最低，然后由低至高依次為B 組、A 組、對照組，提示光動力療法可抑制黑色素瘤細胞中遷移和侵襲相關蛋白的表達水平。鑒于此，考慮在黑色素瘤患者的臨床治療中可開展光動力療法，旨在延緩疾病進程，最大程度地促進患者獲得良好預后。但因此類研究較少見，且本研究結果無較多循證醫學證據作為支持，故本研究結果的真實性、可靠性還需在未來開展大量前瞻性、大樣本量的研究加以驗證。

綜上所述，光動力療法可明顯抑制黑色素瘤細胞的遷移和侵襲，臨床可考慮將光動力療法作為提高黑色素瘤治療效果、促進患者獲得良好預后的重要方法。