高遷移率族蛋白1 在直腸癌中的表達情況及與患者預后的關系

程世豪，樂建培，黃毅婷，馮嘉辰

1上海市靜安區中心醫院檢驗科，上海 200040

2上海市仁濟醫院病理科，上海 200127

直腸癌的發病率普遍較高，約為60%，且發病人群多為老年人，其作為一種免疫原性相對較強的惡性腫瘤，大多會伴有一定程度的淋巴細胞浸潤，可能會直接影響患者的預后。而惡性腫瘤的基本生物學行為特征為局部組織侵襲或一定方式的轉移，最終致死，但機制尚不明確。高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是當前已經證實的一種與體內細胞增殖、代謝、分化等一系列過程存在明顯關系的非組蛋白家族成員；其最初處于細胞核內，作為一種內源性危險信號，參與了多種腫瘤的生理活動。當其釋放到細胞外，會引發機體的相關免疫反應，并且在腫瘤細胞的生長過程中，最終促進組織局部血管生成，有利于腫瘤細胞的侵襲轉移，故其在直腸癌患者預后方面的作用值得研究。當前研究很少將焦點集中于HMGB1 在腫瘤組織內的表達情況、表達位置，以及對直腸癌的潛在意義。故本次研究對HMGB1 在直腸癌患者中的表達情況進行探索，同時明確其在腫瘤細胞內的表達位置，并且通過生存分析明確其對患者預后的影響，一方面，為臨床此類疾病的診斷、治療提供一定的理論依據，另一方面進一步探討其在直腸癌中的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016 年1 月至2017 年10 月上海市靜安區中心醫院收治的直腸癌患者的病歷資料。納入標準：符合直腸癌診斷標準；均行直腸癌根治術；未合并嚴重的臟器損傷；意識清晰，能夠完成正常交流。排除標準：合并精神疾病；治療期間不配合或者拒絕治療；術后隨訪期間依從性差。根據納入、排除標準，共納入78 例直腸癌患者，其中男50例，女28 例；病程2～5 年，平均（3.2±0.7）年。收集78 例患者的腫瘤組織及癌旁組織。

1.2 檢測方法

1.2.1 免疫組化法檢測HMGB1 蛋白的表達情況將獲得的臨床病理組織脫蠟，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）充分清洗3 次，每次5 min；完成后切片并放于室溫環境下30 min，再以PBS 充分清洗3 次，每次5 min。室溫環境下，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）處理10 min，4 ℃條件下加入HMGB1 TREM-1 一抗。PBS 清洗3 次，每次5 min，再加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素液，進行室溫下孵育，10 min 后PBS 清洗3 次，每次5 min，羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗在同樣環境下20 min，PBS 清洗3 次，每次5 min，再次采用Alexa-Fouor 488 羊 抗 兔IgG 二 抗，20 min 后PBS 清 洗3次，每次5 min，最后對獲得的最終樣本采用環辛二烯進行顯色，蘇木精復染，分化，脫水，膠封。由2名以上醫師將最終的免疫組化樣本于光鏡下檢測HMGB1蛋白表達情況，鏡下可見直腸癌組織細胞呈棕色則為HMGB1陽性表達，其他則為陰性表達。

1.2.2 組織內免疫淋巴細胞浸潤情況檢測 組織樣本剪碎，37 ℃RPMI 1640 和HEPES 混合并充分攪拌均勻2 h，有效分離獲得樣本上清，HBSS 清洗3 次，離心后收集淋巴細胞，以單細胞懸液的形式將樣本與鼠抗人CD3-APC、CD45ROPE 熒光抗體混合均勻，并4 ℃孵育30 min，再以流式細胞儀檢測組織內免疫淋巴細胞CD3、CD45RO的表達情況。400 倍顯微鏡視野下觀察到CD45RO細胞個數24 個及以上為高密度，24 個以下為低密度；CD3細胞個數16 個及以上為高密度，小于16 個為低密度。

1.3 觀察指標

①腫瘤組織中HMGB1 與免疫淋巴細胞浸潤情況的關系；②HMGB1 與直腸癌患者臨床特征的關系；③對患者術后隨訪40 個月，了解患者從術后到死亡/復發的生存時間。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計軟件進行數據分析，計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用

χ

檢驗；等級資料的比較采用秩和檢驗；多因素分析采用Cox 風險比例模型分析；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank 檢驗；以

P

﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HMGB1 表達情況的比較

直腸癌組織中HMGB1 表達情況高于癌旁組織，差異有統計學意義（

Z

=3.152，

P

﹤0.05），其中，直腸癌組織中HMGB1 高表達最為突出。（表1）

表1 直腸癌組織及癌旁組織中HMGB1 蛋白表達情況

2.2 不同臨床特征直腸癌患者直腸癌組織中HMGB1 蛋白表達情況的比較

不同病理分期、腫瘤結節情況、CD3浸潤情況、CD45RO浸潤情況、脈管癌栓或神經侵犯情況、淋巴結轉移情況、遠處轉移情況的直腸癌患者的直腸癌組織中HMGB1 蛋白表達情況比較，差異均有統計學意義（

P

﹤0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的直腸癌患者直腸癌組織中HMGB1蛋白表達情況的比較

2.3 HMGB1表達部位與淋巴細胞浸潤情況的關系

對70 例存在HMGB1 表達的組織進一步檢測，其中核表達55 例，核質共表達15 例；HMGB1 核表達的直腸癌組織中淋巴細胞CD3、CD45RO高密度浸潤比例較高，差異均有統計學意義（

χ

=12.035、9.573，

P

﹤0.05）。（表3）

表3 HMGB1不同表達部位的直腸癌組織中淋巴細胞浸潤情況

2.4 生存情況

隨訪40 個月，78 例患者中死亡59 例，生存19例，平均生存時間為（19.89±1.29）個月。比較不同HMGB1表達部位、表達情況、免疫淋巴細胞浸潤情況的直腸癌患者的生存時間發現，HMGB1核表達、HMGB1高表達、CD3低密度浸潤、CD45RO低密度浸潤患者的生存時間分別短于HMGB1 核質共表達、HMGB1 低/無表達、CD3高密度浸潤、CD45RO高密度浸潤患者，差異均有統計學意義（

χ

=12.235、14.560、4.192、5.753，

P

﹤0.05）。（圖1～圖4）

圖1 HMGB1核表達（n=55）與核質共表達（n=15）直腸癌患者的生存曲線

圖2 HMGB1高表達（n=53）與低/無表達（n=25）直腸癌患者的生存曲線

圖3 CD3+高密度浸潤（n=57）與CD3+低密度浸潤（n=13）直腸癌患者的生存曲線

圖4 CD45RO+高密度浸潤（n=55）與CD45RO+低密度浸潤（n=15）直腸癌患者的生存曲線

2.5 直腸癌患者生存時間的影響因素分析

多因素分析發現，HMGB1 表達部位、病理分期、CD3浸潤情況、CD45RO浸潤情況均為直腸癌患者生存時間的影響因素（

P

﹤0.05）。（表4）

表4 直腸癌患者生存時間的影響因素分析

3 討論

HMGB1 在細胞代謝過程方面，是一種能夠與DNA 有效結合的蛋白，可廣泛存在于細胞內，并且能夠有效參與細胞的增殖、生長、運動等一系列過程，對該指標進行早期檢測，有利于直腸癌的盡早發現，為臨床的診療提供重要價值。此外，該指標作為當前臨床腫瘤患者的診斷腫瘤標志物之一，也是臨床靶向治療的靶點之一。有研究顯示，其能夠一定程度有效激活p38、促分裂原活化的 蛋 白 激 酶（mitogen- activated protein kinase，MAPK）等一系列通路，介導腫瘤細胞的持續活化，激發其生長信號。本研究結果顯示，直腸癌組織中HMGB1 表達情況高于癌旁組織，尤其以高表達為主要表現，且經顯微鏡下可見不同程度的染色，充分說明了這一事實。

此外，通過進一步對HMGB1 與患者臨床特征的關系分析發現，不同病理分期、腫瘤結節、CD3浸潤情況、CD45RO浸潤情況、脈管癌栓或神經侵犯情況、淋巴結轉移情況、遠處轉移情況的直腸癌患者的直腸癌組織中HMGB1 蛋白表達情況比較，差異均有統計學意義（

P

﹤0.05）。直腸癌人群中HMGB1 的表達能夠提示患者局部可能存在較為明顯的淋巴細胞浸潤或轉移及遠處轉移等風險，也提示在已經確診為直腸癌的患者中，HMGB1 高表達也與局部腫瘤組織的無限增殖或一定程度的血管生成有關。而有研究發現，對于接受放療之后壞死的直腸癌細胞依舊能夠激活腫瘤細胞的增殖，并且HMGB1 表達水平也會出現一定增高，這也充分說明了該指標是作為患者預后不良的一個新的標志物。另有研究針對轉化控制腫瘤蛋白對機體內的HMGB1 相關行為進行一定的調控，進而促進直腸癌轉移，這充分說明了HMGB1 高表達與直腸癌的復發風險關系緊密，也證實了本研究中提示的HMGB1 與轉移的關系。

此外，進一步對HMGB1 高表達情況與免疫淋巴細胞浸潤的關系進行研究，發現HMGB1 高表達患者直腸癌組織中CD3、CD45RO的浸潤情況較為顯著；對存在HMGB1 表達的組織進一步檢測，發現其細胞核表達與核質共表達共同存在，尤其以核表達情況下的免疫淋巴細胞浸潤情況最為突出。這都提示，直腸癌患者體內HMGB1 表達以核表達為主，并且會伴隨著典型的免疫淋巴細胞浸潤。分析認為，這可能是因為腫瘤細胞內HMGB1釋放至細胞外，可引發機體以CD3、CD45RO為典型代表的記憶性T 淋巴細胞（是腫瘤免疫反應的重要細胞之一）腫瘤相關免疫反應，在腫瘤的病灶組織內其密度相對較高。尤其在HMGB1 高表達情況下，患者可能存在一定程度的轉移風險，局部組織內的免疫淋巴細胞也會相對呈現聚集，密度較大，以最大程度抑制腫瘤細胞的增殖和擴散，這也可能影響患者的生存時間，因此對于直腸癌患者，CD45RO較高急需及時進行臨床干預，以改善患者預后，降低復發風險。而HMGB1一旦釋放至細胞外環境，即可引起相應的樹突狀細胞、巨噬細胞有效活化，進而一定程度上誘導免疫耐受。但是其具體引起免疫調節的機制值得研究。此外，這也說明了HMGB1 在細胞核內表達較高的情況下，免疫淋巴細胞浸潤情況也較為明顯，一定程度上反映了HMGB1 可能通過機體內的免疫機制影響腫瘤進展。

隨訪40 個月，78 例患者中死亡59 例，生存19例，生存時間為（19.89±1.29）個月。比較不同HMGB1 表達部位、表達情況、免疫淋巴細胞浸潤情況的直腸癌患者的生存時間發現，HMGB1 核表達、HMGB1 高表達、CD3低密度浸潤、CD45RO低密度浸潤患者的生存時間分別短于HMGB1 核質共表達、HMGB1 低/無表達、CD3高密度浸潤、CD45RO高密度浸潤患者，差異均有統計學意義（

P

﹤0.05）。通過對生存時間的影響因素進行分析發現，HMGB1 表達部位、病理分期、CD3浸潤情況、CD45RO浸潤情況均為直腸癌患者生存時間的影響因素（

P

﹤0.05）。也提示HMGB1 表達情況與患者的預后可能存在一定的關系，也提示臨床對于結腸癌的治療需要嚴密監測患者術后或化療后的指標，為及時診斷患者是否存在復發、轉移等情況，提供一定的幫助。

綜上所述，HMGB1 在結腸癌組織中高表達，且多存在于細胞核內，HMGB1 高表達的直腸癌患者的病灶內有較為明顯的免疫淋巴細胞浸潤，此類患者生存時間相對較短，這提示可通過機體內的免疫機制而影響腫瘤進展。且經多因素分析發現，HMGB1 表達部位、病理分期、淋巴細胞浸潤均為患者預后的影響因素，而HMGB1 表達不能作為患者預后的影響因素。因此臨床對于結腸癌HMGB1 表達及免疫淋巴細胞動態監測，能夠幫助了解患者的預后情況，為調整治療方案提供一定的幫助。