Ephrin-B3在癲癇大鼠海馬中的動態表達變化

劉田田， 滕軍放， 劉恒方， 張 敏， 肖 波

Ephrin-B3蛋白是一種軸突導向蛋白，由Efnb3基因編碼，位于17號染色體p13.1。研究表明Ephrin-B3在整合多種突觸后膜蛋白、細胞粘附分子、信號成分、其它支架蛋白和突觸后致密物中肌動蛋白細胞骨架時發揮重要作用[1]。Ephrin-B3蛋白已被證實參與在腫瘤、心血管疾病中， 推測其與中樞神經系統疾病的發生、發展有著密切聯系[2]。癲癇是一組由不同病因所引起，是腦部神經元高度異常同步化放電所導致的疾病，臨床上以顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)最為常見，目前認為由遺傳與環境因素共同導致，是難治性癲癇的常見類型[3]。癲癇的發生、發展主要分為急性期、靜止期、慢性期3個時期。病理學研究發現，癲癇后海馬齒狀回顆粒細胞發出的苔蘚纖維可異常出芽至齒狀回的內分子層，與自體或異體神經元樹突建立興奮性突觸聯系，這種新的回返性興奮性環路的形成及強化是腦部神經元同步化放電的機制之一[4]。Armstrong等人研究發現，Ephrin-B3蛋白可與突觸后膜上的親離子型的興奮性谷氨酸受體NMDA的NR2A、NR2B調節亞單位結合形成復合體，調節突觸長時程增強和長時程抑制的功能，參與到神經元突觸的可塑性變化[5]。因此，本研究通過檢測癲癇大鼠模型中Ephrin-B3蛋白的動態表達變化及變化規律，探討其在癲癇發生發展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 由斯萊克實驗動物有限責任公司提供的健康SPF級6～8周齡雄性SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠(體重 250～300g),隨機將大鼠分為實驗組和對照組，在造模后的7 d、14 d、60 d分為3個亞組(每個亞組6只)。

1.2 匹羅卡品癲癇大鼠模型制備 成年雄性SD大鼠稱重后，腹腔注射0.9%氯化鈉注射液稀釋配制127 mg/ml氯化鋰(3 mEq/kg)。18～20 h后，腹腔注射0.9%氯化鈉注射液稀釋的匹羅卡品(25 mg/kg)誘導癲癇持續狀態。根據改良的Racine標準對大鼠急性癲癇發作進行嚴重程度分級[6]。發作達到4～5級即認為大鼠進入癲癇持續狀態，提示致癇成功可以入實驗組。

1.3 實時熒光定量PCR 分別選取各時間點的實驗組和對照組大鼠，將整個腦組織置于冰上操作，剝開表面皮質后可見灰白色海馬組織，用鑷子快速分離出完整海馬組織，根據大鼠立體定位圖譜及體視顯微鏡下找到海馬齒狀回(DG)區，并用12號鈍針頭連接負壓針管，抽取海馬DG區組織，左、右側分別裝于相應標記的1.5 ml凍存管中，迅速置于液氮中冷凍后隨即轉入-80℃的超低溫冰箱中保存備用。稱量20 mg海馬組織(右側)放入研缽中，按照相關步驟提取，并予以驗證。按照試劑盒上說明書操作cDNA的合成，實時熒光定量PCR，根據Maxima SYBR Green/ROXqPCR MasterMix(2×)(#K0221)試劑盒內說明書進行操作，引物設計應用Beacon Designer 8.0軟件(PREMIER Biosoft International,USA)，內參選取β-actin。引物序列為：Ephrin-B3 5’-ACTCAGCCTG GAGCCTGTCTAC-3’,5’-CGATCTGAGGGTAAAGCACGTA-3’；β-actin 5’-AATAAGTGGTTACAGGAAG-3’, 5’-GTATTAAGGCGGAAGATT -3’。

1.4 Western blot分析 配制蛋白酶抑制劑 PMSF和RIPA蛋白裂解液的混合液，在使用前數分鐘內加入和磷酸酶抑制劑 PhosSTOP(RIPA：PhosSTOP：PMSF體積比100∶10∶1)。取20 mg 海馬組織(左側)放在無菌無酶的1.5 ml EP管中，每20 mg組織加入 200 μl裂解液，液氮浴中勻漿5～10 min 直至組織充分裂解，4 ℃ 12000 rpm離心10 min，離心后取上清液，分裝入相應標記的0.1 ml EP管中，-80 ℃冰箱保存；用BCA 法蛋白測定試劑盒，按說明書進行。

1.5 灌注取材與切片 隨機選取致癇后7 d、14 d和60 d的大鼠進行灌注取材。完全暴露腦組織后，眼科鑷離斷連接腦組織的顱神經和脊髓，將腦組織完整取出，手術刀切除小腦腦干，并置于4 ℃ 4%多聚甲醛后固定12 h，隨后將固定后的腦組織梯度脫水，即先轉入4 ℃ 20%蔗糖溶液沉底，之后置于30%蔗糖溶液中直至沉底，整個過程大約需要72 h。將冰凍切片機溫度調至為-20 ℃。將完全沉底后的腦組織取出，手術刀仔細修整腦組織切塊，后部朝下放置切片機基座上，調整切片厚度為25 μm，進行連續冠狀位切片，并采用多聚賴氨酸處理的防脫玻片進行貼片。

1.6 免疫組化染色 取相同部位解剖部位的大鼠海馬組織(Bregma-3.6 mm至-4.0 mm)進行免疫組織化學染色，實驗步驟參照實驗室既往實驗程序及試劑的說明書。免疫組化染色的腦片采用萊卡 DM5000 B 顯微鏡拍攝圖片后采用雙盲法使用Imaging-Pro Plus 6.0(IPP)軟件對大鼠雙側海馬DG區的Ephrin-B3平均光密度進行定量分析，將每個部位6張圖片的陽性產物(淺褐色至深褐色)的光密度值合并取均值，作為評估該部位Eprhin-B3的定量分析指標。

2 結 果

2.1 癲癇大鼠行為學觀察 實驗過程中，我們對于對照組及實驗組大鼠進行行為學觀察，結果顯示：對照組大鼠無癇性發作，活動自如。在SE誘導成功后的7～14 d(急性期、靜止期)，實驗組大鼠均未見自發癇性發作。在60 d(慢性期)，可觀察到實驗組大鼠陸續出現自發癇性發作，主要表現為節律性點頭、咀嚼、單側或雙側前肢陣攣，每次發作可持續數秒至1 min左右不等，發作頻率從1 d數次或數天一次不等。無癲癇發作時大鼠活動自如，自由攝食攝水。

2.2 實驗組大鼠海馬Ephrin-B3 mRNA的表達變化 實時熒光定量PCR方法用于檢測致癇后不同時間點大鼠海馬中Ephrin-B3 mRNA的表達變化，結果(見圖1)。與對照組相比，7 d后匹羅卡品致癇后大鼠海馬中Ephrin-B3 mRNA表達有所下降；14 d下降最為明顯；60 d有所回升，但仍低于對照組。對照組不同時間點間的Ephrin-B3 mRNA表達無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 致癇后不同時間大鼠海馬 Ephrin-B3 mRNA的表達變化。與對照組相比，癲癇后海馬Ephrin-B3的mRNA表達下降，并在14 d時下降最為明顯，差異有統計學意義。Con：對照組；Ep：癲癇實驗組。***P<0.001

2.3 實驗組大鼠海馬Ephrin-B3蛋白的表達變化 Western blot方法用于半定量分析致癇后不同時間點大鼠海馬Ephrin-B3蛋白表達量，結果(見圖2)。與對照組相比，7 d后癲癇大鼠海馬中Ephrin-B3蛋白表達有所下降(對照組3.19±0.35 vs 實驗組1.34±0.31,P<0.0001)；14 d下降最為明顯(對照組3.06±0.33 vs 實驗組1.13±0.06,P<0.0001)；60 d有所回升(對照組3.27±0.05 vs 實驗組1.59±0.14,P<0.0001)，但仍低于對照組。對照組不同時間點間的Ephrin-B3蛋白表達無顯著性差異(P>0.05)。

圖2 Ephrin-B3蛋白在對照組和癲癇組大鼠海馬的表達變化。A：Ephrin-B3蛋白表達的Western blot條帶；B：Western blot結果統計分析圖。與對照組相比，癲癇后海馬的Ephrin-B3在海馬中的表達下降，并在14 d時下降最為明顯，結果有統計學差異。Con，對照組；Ep：癲癇實驗組。***P<0.001

2.4 實驗組大鼠海馬Ephrin-B3 蛋白分布變化 應用免疫組化染色檢測大鼠海馬齒狀回Ephrin-B3蛋白分布情況，代表性染色圖像(見圖3)。在對照組大鼠冠狀切面中Ephrin-B3主要在齒狀回顆粒細胞層和門區的細胞胞膜表達，同時也散在分布于始層、輻射層、透明層和分子層等部位。光密度值結果顯示：與對照組比較，致癇后7 d(對照組0.21±0.002 vs 實驗組0.13±0.04,P=0.0002)；14 d(對照組0.26±0.04 vs 實驗組0.097±0.003,P<0.0001)；60 d(對照組0.26±0.05 vs 實驗組0.217±0.004,P=0.0423)的Ephrin-B3蛋白在海馬DG區光密度值均下降，差異有統計學意義。因此，在海馬DG區，Ephrin-B3的光密度值與Ephrin-B mRNA的表達趨勢一致。

圖3 大鼠海馬Ephrin-B3蛋白在海馬齒狀回的表達變化及分布。A：Ephrin-B3蛋白表達分布的代表性免疫組化圖；免疫組化結果顯示Ephrin-B3主要表達在齒狀回的顆粒細胞層的胞膜表達；B：免疫組化結果統計分析圖。統計結果顯示，與對照組相比，癲癇后海馬齒狀回Ephrin-B3的表達下降，并在14 d時下降較明顯，差異有統計學意義。Con，對照組；Ep：癲癇實驗組。Bar=100 μm。***P<0.001；*P<0.05

3 討 論

海馬硬化是人類顳葉癲癇特征性病理改變，主要為海馬齒狀回門區、CA1及CA3區神經元的丟失，顆粒細胞層彌散化。此外，海馬齒狀回顆粒細胞苔蘚纖維出芽也被認為參與了海馬局部環路的突觸重塑，突觸重塑可打破局部興奮性和抑制性系統平衡，導致了癇性電活動的產生[7]。匹羅卡品癲癇動物模型中發現，大鼠海馬腦片的異位新生神經元靜息電位降低，興奮性增高，具有自發性爆發放電能力，成為自發性癲癇發作的重要誘導因素[8]。但迄今為止，海馬新生神經元興奮性增高的具體分子機制尚不明確。

近年來Eph/ephrin家族蛋白由于其獨特的受體-配體結構和特有的雙向信號轉導通路，在神經發育研究中備受關注。已有研究證實Eph/ephrin家族蛋白通過調控軸突導向、細胞遷移、突觸形成等多個環節，參與學習和記憶[9]。研究表明Ephrin-B3配體蛋白可能參與調節中樞神經系統的多種病理生理活動，包括神經元增殖和遷移、軸突生長和導向、突觸形成和成熟、血管新生等[10]。在胚胎發育過程中，視前區 EphB1/ephrin-B3的逆向信號轉導可以產生兩種作用，一方面可阻礙中間神經元向紋狀體遷移；另一方面可終止紋狀體細胞遷移至紋狀體以外的區域[11]。Eph/ephrin蛋白家族在對于顳葉癲癇異常神經網絡突觸可塑性中的作用研究可作為新的作用靶點有望在人類癲癇治療中取得新的進展；有望挖掘癲癇藥物治療新靶點。

在本研究中，為了更好的觀察Ephrin-B3在癲癇發病中的作用，本研究采用經典的匹羅卡品癲癇大鼠模型，分別于癲癇持續狀態誘發后的7 d、14 d、60 d取海馬組織進行檢測，發現在癲癇持續狀態后急性期，Ephrin-B3表達下降，在靜止期下降顯著，并且在慢性期表達仍然下降，提示Ephrin-B3在海馬組織的動態變化可能是顳葉癲癇慢性自發癲癇形成的機制之一，我們推測隨著癲癇的發生發展，神經元損傷、神經元遷移異常與微環境的改變可能是導致Ephrin-B3蛋白水平下調的原因[12]。Piccinin等人研究發現Ephrin-B3蛋白通過抑制海馬CA1區的谷氨酸受體mGlu(group-I metabotropic glutamate receptor，mGlu)，誘導海馬的長時程抑制[13]。在體外培養的海馬神經元中，EphB2受體與Ephrin-B3結合，調節興奮性突觸前后膜的聚集和成熟，影響興奮性神經元樹突棘的形成[14]。

本實驗的研究發現，癲癇大鼠海馬中的Ephrin-B3在早期表達下降，并在靜止期時下降明顯，慢性期有所回升，這與一些文獻報道不一致，有學者檢測人類顳葉癲癇患者的顳葉皮質中Ephrin-B3配體及受體EphB3的表達,發現Ephrin-B3及EphB3的表達有所增加，接著在顳葉癲癇大鼠的顳葉皮質及海馬CA1區檢測也有所增加[15]。此外，我們之前對于Ephrin-B3在皮質發育不良中的研究發現Ephrin-B3在皮質發育不良癲癇大鼠腦組織中的表達增高。究其原因，可能由于研究的動物模型的差異，樣本量的不同，時間點的不同，以及大腦部位取材的不一致，我們主要研究海馬齒狀回的顆粒細胞下層，而Huang等人是對顳葉皮質及海馬的CA1區Ephrin-B3表達進行檢測；因而我們推測Ephrin-B3是否在不同的細胞中與不同的Eph受體結合發揮相應的生理功能。鑒于此，我們擬計劃收集人類顳葉癲癇的海馬組織標本，在不同海馬分區中檢測Ephrin-B3的表達分布情況，為探討Ephrin-B3在顳葉癲癇發生中的作用提供更多的實驗依據。