探究氯諾昔康誘導骨髓間充質干細胞向成骨分化的效果

竇仁剛 吳婷婷 洪永鋒

摘要：目的 探究氯諾昔康誘導骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的表達效果。方法 取SD雄性小鼠后肢骨髓細胞，采用密度梯度離心全骨髓貼壁法分離、純化、培養出骨髓干細胞，然后用Giemsa染色細胞在顯微鏡下觀察不同階段細胞形狀特征，使用茜素紅染色及ALP染色檢測鈣結節的形成與沉淀情況，并通過PCR檢測三個成骨基因（BMP2、OCN 和 Runx2）的表達效果。結果 與對照組相比，加藥組的鈣結節數量更多（均P<0.05），且加藥組的三個成骨基因（BMP2、OCN 和 Runx2）表達水平更高（均<0.05），表明氯諾昔康具有促進BMSCs向成骨分化的作用。結論 骨髓間充質干細胞在一定濃度的氯諾昔康誘導下，向成骨方向分化。

關鍵詞：氯諾昔康?骨質疏松?骨髓間充質干細胞?成骨分化

1.引言

氯諾昔康是一種新型較低的親脂性非甾體抗炎藥，其具有系統性的鎮痛、解熱和抗炎作用，因為它抑制環氧合酶的作用并因此阻止了前列腺素的生物合成[1]。有研究發現氯諾昔康不但對老年患者關節置換術后康復鎮痛有顯著效果，而且也有相關參考文獻提示在鎮痛的同時有促進成骨形成的作用[2]。骨髓間充質干細胞作為一類具有自我復制能力的多潛能細胞，能夠向成骨細胞、神經細胞等方向分化[3-4]。本研究利用氯諾昔康誘導骨髓間充質干細胞向成骨方向分化，為更多骨質流失疾病治療方法提供理論研究依據，發展新思路。

2 材料與方法

2.1實驗細胞及動物

選用SPF級健康的雄性SD鼠后肢骨髓腔提取骨髓間充質干細胞，小鼠體重為（100 ±10）g。

2.2 實驗試劑

氯諾昔康，DMEM培養基，胎牛血清（FBS），胰蛋白酶，青霉素，鏈霉素，成骨誘導試劑，PCR相關試劑盒及成骨抗體，茜素紅染色試劑盒

2.3 實驗方法

2.3.1 大鼠骨髓間充質干細胞體外提純和培養

選用4周齡的雄性SD小鼠，通過快速脫頸法安樂死SD小鼠，在無菌操作條件下取小鼠的雙側后肢骨髓，用培養基沖洗，直至沖凈為止。然后離心后，使用含有10% FBS基礎液反復吹打重懸的細胞以制備單細胞懸掛。計數后，將單細胞懸液以1×106個/mL的密度接種到25 cm2的培養皿中，在5% CO2恒溫箱中于37°C培養。3天后，對半更換營養液，棄去非貼壁細胞后，當鏡下細胞生長超過容量的80%聚集融合度時，行進一步傳代，傳至P3代用于實驗。

2.3.2 氯諾昔康誘導細胞分化實驗

選用P3代骨髓間充質干細胞按密度為 5×105個/mL鋪種于培養皿中，當細胞融合度為80%左右時，選用不同濃度的氯諾昔康誘導21天，同時用不誘導細胞作為對照組。然后對其行PCR成骨基因檢測和相關染色，將實驗分為5組，（-）組（正常培養基）、（+）組（含成骨誘導液培養基）和加藥組（含成骨誘導液培養基+氯諾昔康），其中加藥組又包含三組不同氯諾昔康濃度組，即10-5 mmol/L組、10-6 mmol/L組和10-7 mmol/L組。

2.3.3 PCR檢測特異性成骨基因表達水平

誘導21天收集細胞，用Trizol 裂解液、氯仿溶液、異丙醇按步驟進行細胞總RNA提取，然后對RNA濃度和純度的OD值進行測定，測完值行逆轉錄，引物配制及聚合酶鏈反應，最后依據擴增產物所得的Ct值與對應標準曲線，用 2-ΔΔCt法分析，對各組mRNA 結果進行作圖比較。

2.3.4 細胞染色

誘導21天后，對細胞進行洗滌，然后用Giemsa染色液，茜素紅染色液避光下孵育0.5h-12h，然后PBS緩慢沖洗后，鏡下拍照。

2.3.5 統計學處理

使用統計軟件SPSS 19.0進行分析，結果表示為平均數±標準差（），通過方差的單向或雙向進行統計學分析，對比結果以p<0.05表示具有統計學意義，該實驗中所有結果均獨立重復至少3次。

3 結果

3.1 骨髓間質干細胞的形態觀察

倒置顯微鏡下觀察骨髓間充質干細胞，細胞形態分散貼壁生長，大小不一，紡錘形細胞，像菌落一樣聚集生長，生長狀態良好，見圖1。

3.2 成骨相關mRNA在不同濃度氯諾昔康組中的表達

不同濃度（10-5 mmol/L、10-6 mmol/L和10-7 mmol/L）氯諾昔康與BMSCs共培養21天后，對各組成骨基因mRNA的表達情況進行比較。如圖2所示，與（-）組相比，（+）組三種成骨基因的mRNA的表達水平均顯著升高（P< 0.05）;與（+）組相比，三個濃度梯度氯諾昔康組三種mRNA表達水平呈增高態勢;不同濃度組組間比較，其中10-6 mmol/L濃度組表達最明顯。

3.3 茜素紅染色

為了驗證PCR成骨基因表達結果，進一步行細胞成骨染色，共培21天后，觀察不同組別茜素紅染色結果，如圖3所示，結果可見，與（-）組相比，（+）組鈣結節表達水平較高（p<0.05）;不同濃度的氯諾昔康組組間比較，其中10-6 mmol/L濃度組鈣結節表達量最多（p< 0.05），與以上實驗結果一致。

4 討論

氯諾昔康作為新型NSAIDs可主要通過抑制環氧化酶活性而降低前列腺素合成， 調節內啡肽等物質分泌， 實現鎮痛效果[5]。研究發現在某種情況下在鎮痛同時具有促進成骨作用，具體機制現在還不清楚。

本研究利用氯諾昔康的特殊作用方式，根據干細胞具有多向分化性，通過體外誘導骨髓間充質干細胞轉化成骨是可行的[6]。首先用氯諾昔康進行誘導干細胞21天，檢測相關成骨基因表達效果，然后行茜素紅染色，結果顯示經氯諾昔康誘導21天后，成骨相關標基因的表達及成骨染色結果效果顯著。由此可見，骨髓間充質干細胞在氯諾昔康的誘導下，向成骨方向分化。

5參考文獻

[1]Helmy HS， El-Sahar AE， Sayed RH， et al.Therapeutic effects of lorno xicam -loaded nanomicellar formula in experimental models of rheumatoid arthritis[J].Int J Nanomedicine， 2017， 12： 7015-7023.

[2]楊云麗， 魏輝明， 張承華， 等.氯諾昔康對老年患者全髖置換術后舒芬太尼皮下自控鎮痛效果的影響[J].中國臨床藥理學與治療學， 2014， 19（02）： 190-195.

[3]Wang B， Wen H， Smith W， et al.Regulation effects of melatonin on bone marrow mesenchymal stem cell differentiation.J Cell Physiol， 2019， 234（2）： 1008-1015.

[4]顧珊，趙高平， 李 喜.小分子化合物誘導細胞重編程研究進展[J].生物技術通報， 2018， 34（1）： 79-83

[5]鄭鎮偉， 王忱， 吳濤.氯諾昔康對大鼠神經性疼痛發生過程中背根神經節內GAP-43和NGF表達的影響[J].中國醫師雜志， 2013， 15 （6）： 767-771.

[6]Akbulut AC， Wasilewski GB， Rapp N， et al.Menaquinone-7 Supplementation Improves Osteogenesis in Pluripotent Stem Cell Derived Mesenchymal Stem Cells[J].Front Cell Dev Biol， 2020， 8： 618760.

基金項目：T 細胞介導的微環境促進干細胞在骨組織工程中應用研究，編號：81600845。

第一作者：竇仁剛，男，安徽六安人，在讀碩士研究生。

通訊作者：洪永鋒，男，安徽黃山人，博士，主任醫師，副教授，碩士研究生導師。E-mail：hy_feng@ 163.com

（1.安徽醫科大學第二附屬醫院康復醫學科?安徽合肥 230601;2.安徽醫科大學附屬口腔醫院正畸科?安徽合肥?230031）