黑沙蒿治療過敏性鼻炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

孫國園，朱小玲，賈 鑫，李斌鑫，董 玉

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙藥藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑部；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院）

黑沙蒿（Artemisaordosica）蒙古名為哈拉-沙巴嘎，又稱沙蒿、鄂爾多斯蒿、油蒿、籽蒿，為菊科蒿屬植物。在我國主要分布于內(nèi)蒙古、河北（北部）及山西，具有良好的防風(fēng)固沙性能[1]。黑沙蒿味辛苦，性微溫。據(jù)《中華本草》記載，黑沙蒿可祛風(fēng)除濕、解毒消腫，主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、感冒頭痛、咽喉腫痛等[2]。研究表明[3]，黑沙蒿的主要活性成分包含黃酮類、揮發(fā)油類和三萜類，香豆素類等，可以增強免疫力，提高氧化功能等。近年來大面積飛機播種使黑沙蒿分布更加廣泛，據(jù)調(diào)查，黑沙蒿在我國分布面積達(dá)37500萬畝[4]。隨著黑沙蒿分布面積的擴大，蒿粉過敏引起的過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）和哮喘病例不斷增加，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)鼐用竦恼Ｉ睢Ｓ袛?shù)據(jù)顯示，全球的過敏性鼻炎患者超過5億[5]。過敏性鼻炎在我國大陸地區(qū)人口中的患病率達(dá)到4%～38%，不同地區(qū)之間差異較大[6]。過敏性鼻炎主要臨床表現(xiàn)為流涕、鼻癢、眼癢、噴嚏、鼻塞和咳嗽等急性過敏反應(yīng)，嚴(yán)重者會引發(fā)過敏性哮喘。目前，西醫(yī)臨床治療過敏性鼻炎常用抗組胺藥、腎上腺皮質(zhì)激素、減充血劑、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑等，其中抗組胺藥、腎上腺皮質(zhì)激素應(yīng)用較多，這些藥物能控制AR癥狀卻不能根治，而且有副作用。最近，有研究人員評估了黑沙蒿提取物對過敏性鼻炎（AR）和體內(nèi)抗炎癥作用減弱效果，結(jié)果表明黑沙蒿提取物能夠減輕卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)的AR癥狀[7]，這為黑沙蒿抗過敏性鼻炎提供了有力的證據(jù)。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探尋黑沙蒿的潛在活性成分、靶點及信號通路，闡釋黑沙蒿抗AR作用機制，為黑沙蒿治療AR提供理論依據(jù)。

1 應(yīng)用的軟件與方法

1.1 軟件（見表1）

表1 軟件

1.2 方法

1.2.1化學(xué)成分的收集及其靶點的預(yù)測 通過查閱文獻(xiàn)搜集黑沙蒿的化學(xué)成分，將所篩選的化學(xué)成分通過Pubchem數(shù)據(jù)庫查詢其結(jié)構(gòu)信息，將查詢到的化合物結(jié)構(gòu)信息輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，以Probability≥0.6為條件預(yù)測其作用靶點，整合、去掉重復(fù)項。

1.2.2疾病靶點的篩選通過TTD、Drugbank、Dis-GeNET數(shù)據(jù)庫篩選出過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的作用靶點。

1.2.3化學(xué)成分及AR共同靶點的獲取在Venny2.1在線軟件上分別導(dǎo)入所選化學(xué)成分和AR作用靶點，繪出韋恩圖，兩者取交集部分，即黑沙蒿抗AR的作用靶點。

1.2.4“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析將“1.2.1”中收集到的化學(xué)成分以及“1.2.3”所獲取的抗AR的作用靶點導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建“成分-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape對藥物中的主要活性成分進(jìn)行分析，節(jié)點的大小代表度值（degree）的大小。

1.2.5PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將“1.2.3”所獲取的抗AR的作用靶點導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”檢索，最低相互作用閾值為0.4，得到蛋白相互作用的信息，將其導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2軟件后繪出PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6通路富集分析用DAVID數(shù)據(jù)庫對潛在作用靶點進(jìn)行GO（gene ontology）富集分析和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析，并分析AR的生物過程和信號通路。

2 結(jié)果

2.1 黑沙蒿中的化學(xué)成分

通過文獻(xiàn)檢索，獲得黑沙蒿中的化學(xué)成分20個[1，3，8，9]（見表2）。

表2 化合物名稱

2.2 化學(xué)成分及AR共同靶點的獲取

通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選出化學(xué)成分的作用靶點，整合、去掉重復(fù)值后得到383個作用靶點。通過TTD、Drugbank、DisGeNE數(shù)據(jù)庫篩選出AR的作用靶點，去掉重復(fù)值后得到413個靶點。將所選化合物靶點和疾病靶點導(dǎo)入Venny2.1在線軟件上，繪出韋恩圖，得到共同靶點63個（見圖1）。

圖1 黑沙蒿有效成分-AR靶點韋恩圖

2.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將收集到的黑沙蒿的成分靶點與AR的作用靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，取所有靶點中共同的部分，繪出網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2），該網(wǎng)絡(luò)共包括35個節(jié)點，183條邊，其中綠色節(jié)點為化合物分子，紅色節(jié)點為藥物靶點，邊為化合物分子與靶點之間的相互關(guān)系。圖中，度值較大的成分分別是黃酮類化合物Genkwanin（HSH-4，芫 花 素）、hydroxygenkwanin（HSH-5，羥基芫花素）、acacetin（HSH-8，金合歡素），cirsimaritin（HSH-9，濱薊素）。度值較大的靶點是ACHE（乙酰膽堿酯酶）、ESR2（雌激素受體）、ADORA1（腺苷A1受體）、ADORA2A（腺苷A2A受體）、ALOX5（花生四烯酸5-脂氧合酶）等。每個化合物與多個靶點相關(guān)聯(lián)，同時，一個靶點被多個化合物作用，體現(xiàn)了黑沙蒿多成分、多靶點的作用機制（見圖2）。

圖2 黑沙蒿活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在STRING數(shù)據(jù)庫中錄入黑沙蒿活性成分與過敏性鼻炎（AR）共同靶點，即抗AR的作用靶點，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”檢索，最低相互作用閾值為0.4，得到PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)，輸入Cytoscape3.7.2軟件，分析并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。圖中，度值越大，節(jié)點越大，其在整個網(wǎng)絡(luò)中就越關(guān)鍵。該網(wǎng)絡(luò)總共包括13個節(jié)點和20條邊，其中，靶點EGFR（表皮生長因子受體）的度值最大；其次是MMP9（基質(zhì)金屬肽酶9）、AR（雄激素受體）、AHR（芳香烴受體）（見圖3），推測EGFR是黑沙蒿治療AR的關(guān)鍵靶點。

圖3 黑沙蒿治療AR的蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 基因功能與通路分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對黑沙蒿活性成分對應(yīng)靶點進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析，GO富集分析包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecularfunction，MF）和細(xì)胞組分（cellular component，CC）3個分支，PValue值設(shè)為小于0.05，并篩選前10個生物過程，用GraphPad Prism 5.0繪圖（見圖4～6）；共富集到4條通路，紅色條形的長短表示基因數(shù)目的多少，綠色條形的長短表示P的負(fù)對數(shù)值，該值越大說明信號通路的顯著性越高（見圖7）。

圖4 黑沙蒿治療AR的BP富集分析

圖7 黑沙蒿治療AR的KEGG通路分析

黑沙蒿抗過敏性鼻炎的BP富集分析結(jié)果（見圖4），作用靶點主要涉及細(xì)胞增殖（cell proliferation）和凋亡過程的負(fù)調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）等。黑沙蒿抗過敏性鼻炎的CC富集分析結(jié)果，靶點主要涉及突觸（synapse）和不對稱突觸（asymmetric synapse）等（見圖5）。MF分析結(jié)果顯示，受體信號蛋白酪氨酸激酶活性（receptor signaling protein tyrosine kinase activity）相關(guān)性最大（見圖6）。雌激素信號途徑（Estrogen signaling pathway）基因數(shù)最多，P負(fù)對數(shù)值最大（見圖7）。

圖5 黑沙蒿治療AR的CC富集分析

圖6 黑沙蒿治療AR的MF富集分析

2.6 黑沙蒿治療AR的活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)模型

將篩選出的黑沙蒿治療AR的活性成分、靶點及通路，輸入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。該圖有21個節(jié)點，55條邊，綠色節(jié)點為活性成分，粉色節(jié)點為潛在靶點，紅色節(jié)點為調(diào)控通路，邊為三者之間的作用關(guān)系，節(jié)點越大，表明黑沙蒿對AR的影響越深（見圖8）。分析結(jié)果表明，參與治療AR的信號通路的關(guān)鍵靶點是CHRM2（毒蕈堿乙酰膽堿受體M2）、ESR2（雌激素受體）、MMP9（基質(zhì)金屬肽酶9）、EGFR（表皮生長因子受體）、SYK（酪氨酸激酶）等，表明它們可能是治療AR過程中的核心作用靶點。由圖可以看出黑沙蒿活性成分通過不同的靶點，不同的調(diào)控通路，共同發(fā)揮抗AR的作用。

圖8 黑沙蒿治療AR的“活性成分-靶點-通路”

3 討論

在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究過程中，活性化合物篩選大多借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）和BATMAN-TCM選取口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的成分。但是以上系統(tǒng)中沒有收錄黑沙蒿化合物相關(guān)信息，所以本文通過文獻(xiàn)收集整理得到黑沙蒿的化學(xué)成分。

過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）也稱為反應(yīng)性鼻炎，是一種常見的衰弱性疾病，通常指由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜I型變態(tài)反應(yīng)。反應(yīng)機制是IgE抗體與肥大細(xì)胞表面Fc受體（FcεRI）結(jié)合，通過FcεRI激活肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，導(dǎo)致其脫顆粒和脫核合成，引起組胺、白三烯、前列腺素和白介素等炎性介質(zhì)的釋放。組胺可提高局部血流量，使血管的通透性增加，引起組織腫脹、瘙癢，從而引起鼻癢、噴嚏和鼻塞等過敏反應(yīng)[10]。因此，調(diào)控氣道上皮細(xì)胞釋放介質(zhì)是治療AR的主要靶點。現(xiàn)代藥理研究證明[11]，中蒙藥復(fù)方、單味藥及其提取物可以抑制IgE的形成，也可抑制組胺等炎性介質(zhì)的釋放等。本文篩選得到的主要活性成分Genkwanin（HSH-4，芫花素）、hydroxygenkwanin（HSH-5，羥基芫花素）、acacetin（HSH-8，金合歡素），cirsimaritin（HSH-9，濱薊素）都屬于黃酮類化合物。研究證明黃酮類化合物具有抗菌、抗病毒、抗氧化自由基、抗炎、鎮(zhèn)痛、提高機體免疫力、抗變態(tài)反應(yīng)等多種藥理活性。圖8中的靶點SYK活化后可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號通路如CJun NH2末端激酶（JNK）途徑和有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑[10]。Genkwanin（芫花素）以濃度依賴性方式抑制JNK途徑中的磷酸化[12]，阻止通過激活SYK依賴的信號通路而導(dǎo)致的肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺、白三烯和細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì)。Acacetin（金合歡素）不僅能夠調(diào)節(jié)Th17/Treg的平衡[13]，還可以有效抑制鼻粘膜上Th2細(xì)胞分泌IL-4等炎癥細(xì)胞因子[14]，對治療過敏性鼻炎具有顯著的療效[15]。Duncan F等研究表明，表皮生長因子受體（EGFR）及其酪氨酸激酶（tyrosine kinase）可上調(diào)MUC基因表達(dá)，參與粘液合成，促進(jìn)鼻粘膜和下呼吸道杯狀細(xì)胞增生，EGFR受體通過Th2細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激反應(yīng)增強氣道粘液分泌。基質(zhì)金屬肽酶（MMPs）既能降解細(xì)胞外基質(zhì)，又能介導(dǎo)蛋白酶活化和細(xì)胞因子分泌，從而影響炎癥過程。有研究表明，在炎癥反應(yīng)后期，過敏原刺激鼻腔，導(dǎo)致MMP9的釋放。Lim等報道長期過敏原激發(fā)可引起鼻粘膜和肺組織相關(guān)的氣道重塑，同時MMP9和組織金屬蛋白酶抑制劑1（Timp-1）表達(dá)增加。過敏性鼻炎患者外周血淋巴細(xì)胞CHRM2受體蛋白表達(dá)明顯升高，CHRM2受體表達(dá)增加與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。過敏性鼻炎中毒蕈堿乙酰膽堿能受體（CHRM2）表達(dá)的變化證明了免疫細(xì)胞膽堿能系統(tǒng)在過敏性氣道疾病中的作用。

KEGG通路分析，富集到4條通路。Lin Hai等研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K-Akt signaling pathway（磷脂酰肌醇3激酶信號通路）能有效地抑制肥大細(xì)胞的活性，從而穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜防止其脫顆粒，抑制組織胺等過敏介質(zhì)的釋放。Fan Z等研究證實，雌激素引起免疫反應(yīng)偏離，促進(jìn)Th2極化誘導(dǎo)過敏反應(yīng)，促進(jìn)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的脫顆粒，引起組胺等炎性介質(zhì)的釋放。雌激素與雌激素受體ESR2（見圖8）結(jié)合活化雌激素信號通路，能夠降低炎癥因子水平，減輕細(xì)胞浸潤。因此，雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）可能是治療過敏性炎癥疾病的關(guān)鍵通路。由此推測黑沙蒿活性成分可能通過雌激素信號通路、PI3K-Akt信號通路等治療AR。在本研究中，癌癥信號通路與膀胱癌通路均與靶點EGFR（表皮生長因子受體）和MMP9（基質(zhì)金屬肽酶9）相關(guān)聯(lián)，可能與AR發(fā)病過程有關(guān)，具體機制需要后續(xù)實驗進(jìn)一步驗證。

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測了蒙藥黑沙蒿有效成分及靶點，并通過生物學(xué)分析，構(gòu)建“活性成分-靶點-通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)、揭示黑沙蒿活性成分-靶點-通路之間的協(xié)同作用，初步探索了黑沙蒿治療AR的作用機制，為進(jìn)一步研究黑沙蒿治療過敏性鼻炎提供理論參考。