益氣定眩飲通過抑制凋亡和促進血管新生改善大鼠腦缺血損傷研究

賀桂蓮 謝劉陽 劉春華 侯帆 朱雯雯 賀宏偉 劉飛

〔摘要〕 目的 從抑制神經元細胞凋亡和促進血管新生角度，探討益氣定眩飲改善大鼠腦缺血損傷的作用機制。方法 97只SPF級健康成年雄性SD大鼠，隨機選取20只為假手術組，其余大鼠采用大腦中動脈線栓法制作腦缺血模型。選取造模成功的60只SD大鼠隨機分為模型組、丁苯酞組、益氣定眩飲組，每組20只，分別予以蒸餾水、丁苯酞膠囊及益氣定眩飲灌胃干預。Zea-Longa法檢測各組1、3、7、14 d時間點腦缺血大鼠神經功能評分，HE染色觀察大鼠腦缺血海馬組織形態學變化，TUNEL法檢測神經凋亡細胞，免疫組化檢測缺血腦組織促紅細胞生成素（EPO）、促紅細胞生成素受體（EPOR）、血管內皮生長因子（VEGF）、腦源性神經營養因子（BDNF）、酪氨酸激酶B（TrkB）蛋白表達。結果 與假手術組比較，模型組細胞凋亡率增高，EPO、EPOR、VEGF、BDNF、TrkB蛋白表達增加（P<0.05）;與模型組相比，丁苯酞組、益氣定眩飲組神經功能缺損評分、細胞凋亡率明顯降低（P<0.05）;EPO、EPOR、VEGF、BDNF、TrkB蛋白表達增加（P<0.05）。結論 益氣定眩飲對大鼠腦缺血損傷后的神經功能、局部神經元細胞形態均具有改善作用，以14 d效果更顯著，推測其可能與上調EPO、EPOR、VEGF、BDNF、TrkB蛋白表達，促進血管新生，改善腦組織供血供氧，從而保護神經元形態與功能、促進受損神經功能修復有關。

〔關鍵詞〕 益氣定眩飲;促紅細胞生成素;血管內皮生長因子;腦源性神經營養因子;酪氨酸激酶B;細胞凋亡;腦缺血

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.08.009

Yiqi Dingxuan Yin Improved Cerebral Ischemia Injury in Rats by Inhibiting

Apoptosis and Promoting Angiogenesis

HE Guilian1， XIE Liuyang2， LIU Chunhua1*， HOU Fan1， ZHU Wenwen3， HE Hongwei1， LIU Fei1

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Gansu University of Political Science and Law， Lanzhou， Gansu 730070， China; 3. Affiliated Fuzhou First Hospital of Fujian Medical University， Fuzhou，

Fujian 350009， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the mechanism of Yiqi Dingxuan Yin in improving cerebral ischemia injury in rats from the perspective of inhibiting neuronal apoptosis and promoting angiogenesis. Methods 97 SPF healthy adult male SD rats， a total of 20 rats were randomly selected as the sham operation group. The other rats were cerebral ischemia model by middle cerebral artery line embolization. 60 SD rats successfully modeled were randomly divided into model group， butylphthalide group and Yiqi Dingxuan Yin group， with 20 rats in each group. Distilled water， butylphthalide capsule and Yiqi Dingxuan Yin were given for intragastric intervention. Zea-Longa method was used to detect the neurological function scores of rats with cerebral ischemia at 1， 3， 7 and 14 days in each group. HE staining was used to observe the morphological changes in the hippocampus of rats with cerebral ischemia. Nerve apoptosis cells were detected by TUNEL method. The expression levels of erythropoietin （EPO）， erythropoietin receptor （EPOR）， vascular endothelial growth factor （VEGF）， brain-derived neurotrophic factor （BDNF）， tyrosinine-stimulated B （TrkB） protein in ischemic brain tissue were detected by immunohistochemistry. Results Compared with sham operation group， cell apoptosis rate and protein expression of EPO， EPOR， VEGF， BDNF， TrkB in model group were increased （P<0.05）. Compared with model group， nerve function deficit score and cell apoptosis rate were significantly decreased （P<0.05）， the protein expression of EPO， EPOR， VEGF， BDNF， TrkB increased （P<0.05） in butylphthalide group and Yiqi Dingxuan Yin group. Conclusion Yiqi Dingxuan Yin can improve the neural function and the morphology of local neurons after cerebral ischemia injury in rats， and with more significant effect of 14 days. It is speculated that it may be related to the up-regulation of EPO， EPOR， VEGF， BDNF， TrkB protein expressionpromoting angiogenesis， improving cerebral blood flow and oxygen supply， thus protecting neurons form and function， promoting restoration of the damaged neural function.

〔Keywords〕 Yiqi Dingxuan Yin; erythropoietin; vascular endothelial growth factor; brain-derived neurotrophic factor; tyrosinine-stimulated B; cell apoptosis; cerebral ischemia

急性缺血性腦卒中（ischemic stroke， IS）是最常見的腦卒中類型，占我國腦卒中的69.6%～70.8%，是嚴重威脅中老年人生命和健康的疾病之一，早期診治意義重大[1-2]。盡管醫療機構開辟綠色通道、建立多學科合作的腦卒中診治團隊，由于急性缺血性腦卒中的治療時間窗窄、很多患者起病時間不明、特異性治療中靜脈溶栓的出血并發癥、動脈溶栓與取栓受醫療和患者個體條件限制、他汀與神經保護藥物的療效尚需進一步證實等原因，仍需積極尋求多種解決方法和藥物[3]。益氣定眩飲是劉祖貽國醫大師辨治腦病理論指導下的臨證常用經驗方，前期臨床研究[4-5]顯示其防治后循環缺血性眩暈療效顯著，不僅能降低血黏度、提高椎-基底動脈血流速度，亦可改善神經功能缺損和眩暈癥狀，推測其療效機制為通過改善椎-基底動脈供血不足和腦缺血缺氧，促進神經功能恢復而改善神經功能缺損癥狀，因前庭神經功能恢復而緩解眩暈癥狀。促紅細胞生成素（erythropoietin， EPO）及促紅細胞生成素受體（erythropoietin receptor， EPOR）是一種刺激人體造血器官、促進紅細胞生成的蛋白，發揮血管新生的作用[6]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）又稱血管通透因子，具有促進血管新生的作用[7]。腦源性神經營養因子（brain derivedneurotr?ophic factor， BDNF）是一種具有神經營養作用的蛋白質，與酪氨酸激酶B（tymsinekinase B， TrkB）結合而在神經系統廣泛表達[8]。益氣定眩飲是否可通過上調EPO/EPOR、VEGF、BDNF/TrkB蛋白的表達，促進腦組織血管新生，改善腦組織缺血缺氧，從而達到保護神經元形態與功能、促進受損神經功能修復的作用？本實驗通過采用大腦中動脈線栓法（middle cerebral artery occlusion， MCAO）建立大鼠腦缺血模型，觀察益氣定眩飲對腦缺血損傷的神經功能、局部神經元形態改善的作用，并探討其可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1? 實驗動物

健康雄性SD大鼠，體質量250～280 g，97只，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供（動物合格證號：1107271911003822），購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（湘）2019-0004]，飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心[使用許可證編號：SYXK（湘）2019-0009]。室溫20～25 ℃，濕度50%～70%，自由進食、飲水，適應性喂養1周，術前12 h禁食不禁水。

1.2? 主要藥物、試劑及儀器

益氣定眩飲（湖南省中醫藥研究院附屬醫院藥劑科）;丁苯酞軟膠囊（H20050299，石藥集團恩必普藥業有限公司生產）;2636A4型MCAO線栓（北京西濃科技有限公司）;TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（C1098，碧云天生物科技有限公司），EPO一抗（A5663）、VEGF一抗（A11127）、BDNF一抗（A10760）、TrkB一抗（A2099）均來自武漢Abclonal公司，EPOR 一抗（bs-1424r，北京博奧森生物技術有限公司），通用型二步法檢測試劑盒（pv-9000，北京中杉金橋生物科技有限公司）;CM3050S型冰凍切片機、SYD-B型石蠟包埋機（德國Leica公司）;CX23型光學顯微鏡（日本Olympus公司）;電子天平（北京六一儀器廠）。

2 實驗方法

2.1? 分組

造模前隨機取20只為假手術組，其余77只大鼠進行造模。在本實驗中，大鼠造模失敗共17只，總計模型制備成功率約77.9%。隨機選取造模成功的60只大鼠采用隨機數字表法分為模型組、丁苯酞組和益氣定眩飲組，每組20只。

2.2? 模型制備及神經功能評分

采用大腦中動脈線栓法[9]制作腦缺血模型。假手術組大鼠予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，每100 g體質量0.35 mL，大鼠麻醉成功后，仰臥位固定，頸部正中切口，分離并暴露右側頸總動脈及頸內、外動脈后縫合切口。待實驗動物清醒后，進行Zea-Longa神經功能評分[10]，神經功能評分標準為：（1）無神經功能損傷癥狀，動物正常活動、進食，評0分;（2）將動物尾巴提起后，左前肢屈曲，評1分;（3）將動物放置平板上，向左側轉圈，評2分;（4）將動物放置平板上，用手輕推向左側傾倒，評3分;（5）動物左側偏癱，不能自發行走，意識朦朧或喪失，評4分。模型成功標準：評分大于或等于2分，則表明模型成功，低于2分則予以剔除。

2.3? 給藥干預

各組大鼠再隨機分為4個亞組，每個亞組5只大鼠，分別給與相應藥物干預1、3、7、14 d，每日灌胃1次，具體如下：

（1）益氣定眩飲組：黃芪30 g、赤芍10 g、川芎6 g、紅花10 g、地龍10 g、葛根45 g、制何首烏10 g、熟地黃15 g、制南星9 g、天麻10 g、絲瓜絡15 g、鬼箭羽30 g，常規煎煮濃縮，得生藥濃度為1.6g/mL，按動物與人體表面積折算給藥劑量。

（2）丁苯酞組：將丁苯酞軟膠囊內的藥物倒出，按動物與人體表面積折算給藥劑量，加蒸餾水稀釋成10 mL/（kg·d），每日灌胃1次。

（3）假手術組及模型組用相應劑量蒸餾水以10 mL/（kg·d），每日灌胃1次。

2.4? 標本取材與制備

假手術組及其余組造模成功的大鼠分別于干預1、3、7、14 d后觀察神經功能缺損評分。并在干預1、3、7、14 d時取各亞組5 只大鼠，予以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，打開胸腔予以生理鹽水及4%多聚甲醛磷酸鹽進行左心室灌注，斷頭取腦，用直鑷從大腦基底部剝取大腦，從視交叉處冠狀位切為兩半，除去嗅腦、小腦和腦干，剩余腦組織置于4%多聚甲醛固定12 h，再用蒸餾水沖洗浸泡24 h，取視交叉前后2 mm脫水、透明、包埋，分別做HE染色、細胞凋亡檢測和免疫組化檢測。

2.5? HE染色觀察腦組織形態

將包埋后的海馬區腦組織連續冠狀切片，脫蠟后行蘇木素染色、鹽酸乙醇分色、自來水浸泡返藍、伊紅染色、二甲苯透明。染色完成后中性樹膠封片，常溫晾干，在光學顯微鏡下觀察腦組織結構、神經元數量、細胞核形態、胞質染色情況。

2.6? TUNEL法測定神經細胞凋亡

取包埋后的海馬區腦組織切片、脫蠟，蛋白酶K作用，3%過氧化氫溶液孵育，生物素標記，滴加標記反應終止液，Streptavidin-HRP工作液，DAB顯色，蘇木素細胞核染色，二甲苯封片觀察。光鏡下凋亡細胞核呈棕黃色，計算凋亡細胞所占的百分比。

2.7? 免疫組化法測定腦組織中EPO/EPOR、VEGF、BDNF/TrkB蛋白表達

取包埋后的海馬區腦組織切片，過氧化氫浸泡，濕盒中進行一抗孵育，加二抗，PBS沖洗，DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色結果，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹膠封片，將切片置于光學顯微鏡下觀察，采用Scan Scope數字病理掃描系統計數陽性細胞數，其中陽性細胞數為棕黃色顆粒或胞質染成黃色。

2.8? 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計處理。計量資料以“x±s”表示，先進行正態分布檢驗：符合正態分布者，兩組間比較采用成組t檢驗，多組組間比較采用單因素方差分析;不符合正態分布者采用非參數檢驗。均以P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1? 各組大鼠神經功能學評分

假手術組大鼠Longa評分結果為0分，神經功能表現正常;模型組、丁苯酞組及益氣定眩飲組的大鼠Longa評分在1～4分之間，與假手術組比較Longa評分差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組同時間點比較，干預后1 d的Longa評分與丁苯酞組、益氣定眩飲組無顯著性差異（P>0.05），3、7、14 d的Longa評分較模型組下降，差異有統計學意義（P<0.05）;丁苯酞組與益氣定眩飲組相同時間點的差異無統計學意義（P>0.05）;益氣定眩飲組與丁苯酞組3、7、14 d與1 d比較Longa評分差異有統計學意義（P<0.05）;益氣定眩飲組14 d與3 d比較Longa評分差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

3.2? 各組大鼠海馬區神經元細胞的形態學變化

假手術組大鼠腦組織海馬區神經元細胞結構完整，形態正常，排列整齊，核膜清晰，胞質染色均勻;模型組缺血腦組織海馬區神經元細胞減少，形態、結構破壞，排列紊亂，細胞膜破裂，細胞核出現固縮、變性、壞死、形成空洞，胞質染色變淺;與模型組比較，丁苯酞組、益氣定眩飲組在3、7、14 d組海馬區神經元細胞數量增多，形態、結構破壞較輕，排列稍紊亂，細胞膜破裂不明顯，細胞核少量固縮、變性。見圖1。3.3? 各組大鼠細胞凋亡情況

假手術組大鼠腦缺血組織未見凋亡細胞;模型組、丁苯酞組、益氣定眩飲組大鼠缺血側可見凋亡細胞出現，模型組細胞凋亡率逐漸升高，到第7天達到高峰;與假手術組比較，模型組、丁苯酞組、益氣定眩飲組大鼠凋亡率明顯升高（P<0.01）;與模型組同時間點比較，丁苯酞組、益氣定眩飲組3、7、14 d大鼠腦組織細胞凋亡率明顯降低（P<0.05），且隨著干預時間的增加，細胞凋亡率逐漸下降，14 d組細胞凋亡率最低;與丁苯酞組同時間點比較，益氣定眩飲組細胞凋亡率差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2和表2。

3.4? 各組大鼠EPO、EPOR蛋白表達情況

與假手術組比較，在1、3、7、14 d，模型組和丁苯酞組、益氣定眩飲組海馬區的EPO、EPOR蛋白表達水平升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，在3、7、14 d，丁苯酞組和益氣定眩飲組中海馬區的EPO、EPOR蛋白表達水平升高，差異具有統計學意義（P<0.05）;而益氣定眩飲組與丁苯酞組同時間點相比差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3-5。

3.5? 各組大鼠VEGF蛋白表達情況

與假手術組比較，模型組和丁苯酞組、益氣定眩飲組在不同時間點海馬區的VEGF蛋白表達水平升高（P<0.05），差異有統計學意義;與模型組比較，在3、7、14 d，丁苯酞組和益氣定眩飲組中海馬區的VEGF蛋白表達量升高（P<0.05），差異有統計學意義;而益氣定眩飲組與丁苯酞組同時間點相比差異無統計學意義（P>0.05）。見圖6-7。

3.6? 各組大鼠BDNF/TrkB蛋白表達情況

與假手術組比較，模型組、丁苯酞組和益氣定眩飲組在不同時間點海馬區的BDNF、TrkB蛋白表達水平升高（P<0.05）;與模型組比較，在3、7、14 d，丁苯酞組和益氣定眩飲組中海馬區的BDNF、TrkB蛋白表達量升高，差異有統計學意義（P<0.05）;但益氣定眩飲組和丁苯酞組同時間點相比差異無統計學意義（P>0.05）。見圖8-10。

4 討論

急性缺血性腦卒中屬于中醫“中風病”范疇，“氣虛血瘀”為最主要的病理機制，清代王清任《醫林改錯》中補陽還五湯為治療代表方，具有益氣活血通絡之功效。隨著中醫學的發展，及對“中風病”的不斷研究，逐漸認識到該病具有病因復雜、病機多端、病勢變化迅速、等多種特點。常見的病因有風痰阻絡、風火上擾、陰虛風動、氣虛血瘀、肝腎虧虛[11]。益氣定眩飲是在補陽還五湯的基礎上進行加減，兼具益氣活血、補腎益髓、祛風化痰3種功效。

腦缺血發生后產生的級聯反應可以引起自由基的改變、氧化應激、炎癥反應等，這一系列的病理生理學變化，最終導致神經細胞凋亡[12-13]。血管新生是IS恢復過程中的重要因素，腦缺血后通過新生血管增加了腦缺血區血流的供應，促進了新生血管網的形成，為缺血缺氧腦組織提供能量，促進神經功能損傷的修復[14-15]。該過程釋放血管生成因子包括EPO、VEGF、BDNF等[16-17]。

EPO又稱紅細胞刺激因子、促紅素，主要由腎臟和肝臟分泌，基本功能是促進紅細胞生成。在正常人腦組織中EPO蛋白水平表達較低，但在缺氧狀態下會明顯增加，這表明EPO可能有自身保護性作用，對神經損傷有修復作用。研究[18-21]顯示：EPO作為中樞神經系統內源性的細胞因子，可通過神經元與膠質細胞的旁分泌作用，作用至神經元EPOR，從而激活下游通路信號轉導，參與缺血后的腦保護;可以使MMP-9的表達減少，TGF-β1的表達增多起到神經保護作用;也可通過激活AMPK，上調KLF2的表達，增加NO產生，進而提高血管新生。

VEGF作為目前最強的血管通透因子，是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，具有促進血管新生的作用，對MCAO細胞恢復具有重要作用[22]。在發生了腦缺血損傷后，相比于損傷發生之前，腦組織內VEGF的表達顯著提高[23]。VEGF與其受體結合后，一方面促使微血管內皮細胞增殖、遷移，誘導新血管生成，改善局部血供，并保護內皮細胞不發生程序性死亡;另一方面能促進微血管新生來維系腦微環境穩定和改善病理狀態下的微環境以保護神經元，是脈絡滲灌氣血發揮對腦神經營養作用的生物學基礎之一[24]。

BDNF是神經營養因子家族的主要成員之一，有促進腦缺血大鼠神經發生和血管生成的作用[25]。大鼠海馬區神經保護因子對神經元缺血損傷較為敏感，而BDNF可通過與TrkB相結合，啟動細胞內信號轉導途徑，發揮神經保護作用[26-27]。有研究[28]表明其原理主要通過拮抗細胞內Ca2+超載興奮氨基酸毒性，增強抗氧化酶的活性，減輕氧自由基的損傷，抑制細胞凋亡壞死和Caspase-3活性，調節Bax和Bcl-2表達來實現神經細胞的再生修復和功能恢復。丁苯酞是我國自主研發的藥物，具有促進缺血性腦卒中后側枝血管的形成、改善腦組織能量代謝、清除自由基、抑制神經元凋亡和焦亡、保護神經元等多重作用[29]。

本研究中，腦缺血后大鼠海馬區EPO、EPOR、VEGF、BDNF、TrkB蛋白表達均有不同程度的增多，益氣定眩飲干預后其上調作用更明顯，并能改善神經功能缺損、細胞形態學改變，細胞凋亡程度降低，且隨著干預時間的增加，其效果更顯著，推測其可能通過上調內源性EPO、EPOR、VEGF、BDNF、TrkB蛋白，從而促進血管新生，改善腦缺血損傷，保護腦缺血海馬神經元細胞。綜上所述，益氣定眩飲與丁苯酞均能促進腦缺血損傷大鼠神經功能的恢復，保護缺血損傷神經元細胞。課題組后期將進一步從信號通路和細胞凋亡方面明確益氣定眩飲保護腦缺血神經功能的具體機制。

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