莪術油乳膏外用對大鼠的長期毒性實驗研究

李文靜 劉 軍 包亞男 洪 博

齊齊哈爾醫學院藥學院，黑龍江齊齊哈爾 161006

莪術性溫，味辛、苦，來源于姜科植物蓬莪術、廣西莪術或溫郁金的干燥根莖[1-2]。有行氣破血、消積止痛的功效，屬活血化瘀要藥[3-4]。具有抗腫瘤、抗菌、升高白細胞、抗炎等藥理作用[5-8]。莪術中主要含揮發油、黃酮類、萜類等化學成分[9-11]。其中，莪術油的臨床應用較廣泛，具有行氣活血、消積止痛、活血化瘀、增強機體免疫能力之功效[12-14]。多項實驗研究證實，莪術油可改善乳腺癌癌前病變大鼠的血液黏度等指標，其活血化瘀的藥理作用可能是防治乳腺癌的作用機制之一[15-17]。

正常乳腺組織惡化成帶有惡性腫瘤的乳腺組織是一個漸進的過程，在乳腺癌變之前這一發展過程是可逆的。根據中醫理論，血瘀是乳腺癌癌前病變重要辯證，所以，本研究在以往的文獻研究基礎上，著眼于中醫藥的活血化瘀理論，結合大量的前期試驗數據研制了莪術油乳膏用于乳腺增生的防治。該制劑制備工藝簡單且質量可控，為進一步完善該制劑的開發，長期毒性試驗是必不可少的，本研究旨在考察外用藥莪術油乳膏對實驗大鼠長期連續經皮給藥的毒性反應及皮膚局部用藥的安全性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

BP211D 精密電子天平（上海耀壯檢測儀器設備有限公司，精密度為0.1 mg）；Velocity 14R 臺式離心機（澳大利亞Dynamica 公司）；ADVIA2120 型全自動血球分析儀（德國西門子公司）；AU5421 型全自動生化分析儀（日本Olympus 公司）。莪術（批號：20150329）藥材購自亳州市國峰藥業銷售有限公司，產地為安徽亳州，經齊齊哈爾醫學院中藥研究室郭麗娜教授鑒定為姜科植物蓬莪術Curcuma phaeocaulis的干燥根莖。乳膏基質[齊齊哈爾醫學院藥學院提供，由十六醇、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-8 蜂蠟、單硬脂酸甘油酯、甘油、月桂醇硫酸鈉、白凡士林和純化水組成]。

1.2 研究對象

雌性美國斯潑累格·多雷（Sprague Dawley，SD）大鼠體重為200～230 g，購自于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物使用許可證編號：SCXK（京）2007-0001，本研究經過動物倫理委員會審核同意開展。動物飼養環境：溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。換氣次數10～15 次/h，照明時間每日12/12 h 交替照明。

1.3 方法

1.3.1 制劑制備 莪術油提取：取粉碎后的莪術藥材10 g，置于揮發油提取裝置的燒瓶中，最終得提取液為50 mL。取莪術油提取物10 mL，加入白凡士林18 g，十六醇28 g，PEG-8 蜂蠟18 mL 和單硬脂酸甘油酯32 g 于研缽中，置水浴加熱至75℃熔化，作為油相。另取月桂醇硫酸鈉24 g、甘油70 mL 和蒸餾水500 mL加熱至同樣溫度，作為水相。將水相細流狀攪拌條件下加至油相中，溫度降至60 ℃時加入主藥，繼續研磨直至冷卻即得。置于棕色試劑瓶中保存備用，乳膏中莪術油含量為0.014 mL/g。

1.3.2 動物分組及給藥 將30 只雌性SD 大鼠隨機分為空白對照（乳膏基質）組，完整皮膚組和破損皮膚組3 組，每組10 只。給藥前24 h 用電推給大鼠胸部剃毛，脫毛部位為以乳頭為圓心，1 cm 為半徑的圓。破損皮膚組用針頭在剃毛后大鼠皮膚上劃“井”字至滲血[18]。將待測乳膏及空白基質分別應用于對應組的大鼠胸部，用藥劑量為10 mg/cm2，每天2 次，連續給藥3 個月。

1.3.3 一般情況觀察 試驗期間每日記錄各組大鼠的攝食、行為活動、精神狀態、食欲等日常情況，及大鼠有無死亡情況。每周固定時間給大鼠稱重1 次，并適當調整給藥劑量。期間如果發現有中毒反應的大鼠應馬上隔離，并觀察、記錄，如何有死亡大鼠應及時進行病理學檢查。

1.3.4 血液樣品測定 用全自動血球分析儀對大鼠腹主動脈血進行血常規檢查：紅細胞（red blood cell，RBC）、白細胞（white blood cell，WBC）、血紅蛋白（haemoglobin，HGB）、中性粒細胞百分比（neutrophil percentage，NEUT）、血小板計數（platelet count，PLT）、單核細胞百分比（monocyte percentage，MONO）、淋巴細胞比值（lymphocyte ratio，LYMPH）、嗜酸細胞百分比（eosinophilic percentage，EO）、嗜堿細胞百分比（basophile percentage，BASO）。

取血球分析剩余的全血離心10 min（速度4000 r/min，半徑10 cm），用全自動生化分析儀檢測血液生化各項指標：谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（aminotransferase，ALT）、谷氨酰轉肽酶（gamma-glutamyl transferase，GGT）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）、血清前白蛋白（preserum albumin，PA）、尿素（Urea）、尿酸（uric acid，UA）、肌酐（creatinine，Crea）。

1.3.5 病理檢查3 個月后，對各組大鼠進行解剖，觀察心、肝、脾、肺、腎、卵巢等主要臟器的外觀及硬度等有無明顯病變。通過公式（質量/體重×100%）計算各主要臟器系數，主要臟器及皮膚標本進行HE 染色試驗（200×）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠一般情況結果的比較

實驗期間，三個實驗組大鼠生長發育良好，均未出現中毒反應，且無死亡現象。各組大鼠行為活動比較，差異無統計學意義（P>0.05），肉眼觀察臟器的形態和硬度等均未見異常。各組大鼠的食量和體重在正常范圍內增長，給藥前后的體重組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）；給藥前后的體重同組比較，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

表1 三組大鼠給藥前后體重的比較（g，±s）

表1 三組大鼠給藥前后體重的比較（g，±s）

組別只數給藥前給藥3 個月后t 值P 值空白對照組完整皮膚組破損皮膚組10 10 10 208.02±5.39 209.08±4.35 206.34±5.47 367.23±8.47 363.82±7.62 367.84±7.82 50.148 55.769 53.515 0.000 0.000 0.000

2.2 三組大鼠血常規指標的比較

連續外用給藥3 個月后，破損皮膚組的WBC 高于空白對照組，破損皮膚組的HGB 低于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；BASO 在三組中無表達，EO 在三組表達水平接近，均為0.03%；其余指標組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表2）。

表2 三組大鼠血常規指標的比較（±s）

表2 三組大鼠血常規指標的比較（±s）

與空白對照組比較，aP＜0.05；“-”表示無數據

組別只數 RBC（×1012/L）WBC（×109/L）HGB（g/L）NEUT（%）MONO（%）BASO（%）EO（%）LYMPH（%）PLT（×109/L）空白對照組完整皮膚組破損皮膚組F 值P 值10 10 10 8.31±0.13 8.08±0.29 8.19±0.08 3.458 0.162 6.64±0.32 6.05±0.33 7.79±0.34a 13.394 0.027 153.08±5.94 145.43±5.60 138.44±5.72a 7.621 0.049 0.34±0.04 0.36±0.05 0.39±0.11 4.902 0.339 0.035±0.00 0.039±0.01 0.041±0.01 5.126 0.305 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00--0.03±0.01 0.03±0.01 0.03±0.00 1.471 0.799 0.68±0.06 0.74±0.06 0.82±0.06 2.210 0.150 839.39±13.28 863.04±15.62 903.76±44.27 4.350 0.056

2.3 三組大鼠血液生化指標的比較

連續外用給藥3 個月后，破損皮膚組的PA 水平高于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；其余指標組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表3）。

表3 三組大鼠血液生化指標的比較（±s）

表3 三組大鼠血液生化指標的比較（±s）

與空白對照組比較，aP＜0.05

組別只數AST（U/L）ALT（U/L）GGT（U/L）TBA（μmol/L）TBil（μmol/L）PA（g/L）Urea（mmol/L）UA（μmol/L）Crea（μmol/L）空白對照組完整皮膚組破損皮膚組F 值P 值10 10 10 141.84±7.31 134.36±11.21 125.64±9.76 2.551 0.254 45.04±4.12 39.86±5.96 38.20±4.23 3.574 0.061 2.36±0.76 2.22±0.82 2.24±0.61 1.221 0.652 9.31±1.17 10.36±1.54 10.45±2.54 3.911 0.051 1.85±0.23 2.37±0.53 2.01±0.66 3.353 0.099 1.05±0.29 2.25±0.32 3.13±0.67a 4.732 0.001 7.11±0.97 6.42±1.09 6.26±1.53 3.045 0.052 93.45±7.18 93.03±11.58 89.27±9.80 2.495 0.556 34.42±6.30 36.52±6.23 30.77±2.81 2.932 0.176

2.4 三組大鼠主要臟器系數結果的比較

各組大鼠的臟器系數比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表4）。

表4 三組大鼠主要臟器系數結果的比較（%，±s）

表4 三組大鼠主要臟器系數結果的比較（%，±s）

組別只數心肝脾肺腎卵巢空白對照組完整皮膚組破損皮膚組F 值P 值10 10 10 1.32±0.12 1.35±0.10 1.14±0.16 1.373 0.212 8.19±0.95 8.43±0.66 7.52±0.97 1.195 0.371 0.79±0.10 0.73±0.12 0.69±0.12 3.152 0.055 1.61±0.12 1.66±0.13 1.56±0.19 2.987 0.056 2.83±0.36 2.77±0.51 2.51±1.80 1.995 0.164 0.09±0.03 0.09±0.03 0.09±0.04 1.080 0.979

3 討論

乳腺增生癥與內分泌功能紊亂密切相關，治療包括一般治療、藥物治療和手術治療[19]。一般治療是指平時注意清淡飲食，禁食辛辣刺激及含有雌激素的食物，保持良好的心情和規律作息。如果疼痛癥狀比較明顯，可以選擇服用一些中成藥來進行藥物治療，如乳癖消等，或一些激素類西藥，比如三苯氧胺等[20]；但是有一些乳腺增生形成結節，性質難以明確的需要手術治療。其中，藥物是最常用的治療手段，但口服藥物的副作用限制了其應用。中藥外用制劑在乳腺增生的治療上具有靶向性好、毒副作用小等特點。

本研究中，莪術油乳膏對大鼠體重無明顯影響，比較各組大鼠行為活動，差異無統計學意義（P>0.05），肉眼觀察臟器的形態和硬度等均未見異常；皮膚破損組的HGB 水平低于空白對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）；皮膚破損組PA 水平高于空白對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）；其余指標與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。個別指標在破損皮膚組的差異表現可能是皮膚破損后，外用藥物刺激所致，但對于正常皮膚組各指標均無顯著影響，提示對正常皮膚無刺激等副作用。

綜上所述，本研究的外用莪術油乳膏對實驗大鼠未見明顯的長期毒性。